研究背景与目的肿瘤耐药、转移和复发是恶性肿瘤临床治疗失败及患者死亡的主要原因,寻找耐药和转移的相关基因是阐明肿瘤耐药和转移机制,解决肿瘤临床治疗的关键。本研究拟利用肿瘤干细胞表面标记物——CD133,通过磁式分选的方法对肺癌细胞株中的CD133阳性细胞及CD133阴性细胞进行分选,并对其生物学特性进行鉴定。在此基础上,利用转移和耐药两种基因芯片对CD133阳性/阴性细胞进行对比检测,筛选转移、耐药的差异基因,旨在为肿瘤转移、耐药机制的研究提供新线索,为肺癌的基因治疗提供新靶点。方法一、免疫组化方法检测81例肺癌石蜡包埋组织及10例正常肺组织中CD133的表达,观察CD133在组织中表达和分布情况;统计分析CD133表达与肿瘤组织学类型、肿瘤分级、临床分期的关系。免疫细胞化学方法检测CD133在人肺腺癌细胞株A549中的表达。二、分别采用阳性分选柱(MS柱)和阴性分选柱(LD柱)通过磁式分选的方法对人肺腺癌A549细胞株中CD133阳性细胞、CD133阴性细胞进行分选,并用免疫荧光染色法对分选细胞进行细胞纯度鉴定。三、CD133阳性细胞及CD133阴性细胞分别在不含血清的DMEM-F12培养液(含EGF、bFGF)中进行体外培养,观察生长情况及“sphere”形成情况。四、平板克隆形成实验检测CD133阳性细胞、CD133阴性细胞及未分选细胞克隆形成率,比较三者的增殖能力。五、取形成“sphere”的CD133阳性细胞加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培基(不含bFGF、EGF)进行体外诱导分化培养,观察诱导分化前后细胞的形态差异;免疫细胞化学方法检测诱导分化前后细胞CD133、CK7的表达情况。六、采用SuperArray第二代功能分类基因芯片对CD133阳性细胞及CD133阴性细胞分别进行肿瘤转移基因(84个转移相关基因)、耐药基因(84个耐药相关基因)的对比检测,结合生物信息学技术分析两组之间的差异基因。结果一、肺癌组织中CD133阳性肿瘤细胞呈分散或小灶状/巢状分布于癌巢边缘,数量稀少。81例肺癌标本CD133表达阳性率为53.1%(43/81),CD133表达与各组织学类型的关系分析显示:鳞癌、腺癌及其他类型阳性率分别为48.3%(14/29)、52.9%(18/34)和61.1%(11/18),CD133的表达与组织学类型无关(P>0.05),与肿瘤分级及临床分期无关(P>0.05)。10例正常肺组织中均未见CD133阳性细胞。二、免疫细胞化学染色结果显示:人肺腺癌A549细胞株中有CD133阳性细胞存在,数量稀少。三、通过阳性分选柱(MS柱)从人肺腺癌A549细胞株中分选出的CD133阳性细胞率约为0.2%。四、免疫荧光染色CD133阳性细胞发红色荧光。经MS柱分选的CD133阳性细胞中绝大部分细胞发红光荧光;经LD柱分选的CD133阴性细胞中仅见少量细胞发微弱的红色荧光,表明磁式分选所获得细胞纯度较高。五、分选细胞培养可见,CD133阴性细胞组培养24小时见部分细胞呈贴壁生长,CD133阳性细胞组虽有细胞贴壁,但数量明显少于CD133阴性细胞组。两组贴壁生长的细胞培养8周全部死亡。CD133阳性细胞组培养过程中大多数细胞呈悬浮生长状态,持续可见少量细胞贴壁,于培养第9天出现“sphere”;CD133阴性细胞组悬浮细胞培养8周未见“sphere”形成。六、平板克隆形成实验可见CD133阳性细胞、CD133阴性细胞、未分选细胞组平均克隆形成率分别为57.1%、3.3%、8.7%,三组间克隆形成率差异有统计学意义(P<0.05)。七、血清诱导分化的CD133阳性细胞免疫细胞化学染色结果显示:诱导分化前细胞CD133阳性、CK7阴性;诱导分化后细胞CD133阴性、CK7阳性。八、基因芯片检测结果显示:与CD133阴性组相比,CD133阳性组84个耐药基因中表达水平降低达两倍或以上的有30个,差异最高达8.9倍,表达水平升高的1个,差异为2.5倍;84个转移基因中表达水平降低达两倍或以上的有19个,差异最高达12倍。结论一、人肺癌组织中有CD133阳性细胞,数量稀少,呈小灶状分布。CD133的表达水平与肿瘤组织学类型、肿瘤分级、临床分期无关。二、采用磁式分选的方法成功从人肺腺癌A549细胞株中分选出CD133阳性和CD133阴性细胞。三、体外实验证实CD133阳性细胞能在无血清培基中生长并形成“sphere”,可在体外诱导分化,具有高增殖潜能,提示CD133阳性细胞具有肿瘤干细胞特性,CD133阳性细胞与阴性细胞生物学特性具有明显差异。四、耐药基因芯片检测结果提示RARG可能在CD133阳性细胞耐药机制中起重要作用。五、转移基因芯片检测结果提示CD133阳性细胞的高增殖潜能及黏附性降低、免疫逃逸可能在肿瘤转移过程中发挥主要作用;CD82可能在CD133阳性细胞转移机制中起重要作用。