【摘 要】
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甘蔗是一种重要的糖料作物,虫害对甘蔗产量造成了巨大的损失。Bt抗虫基因具有广谱杀虫性,培育转Bt基因抗虫品种为防治甘蔗虫害提供了新的思路。在作物的转Bt基因抗虫育种中,应用最多的一类Bt杀虫蛋白是Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac,这三种毒素的同源性比较高,它们在受体类钙粘蛋白上具有不完全重叠的同一结合位点,昆虫对这三种毒素具有较强的交互抗性,因此Cry1A毒蛋白难以适应抗性管理的需要。作为
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甘蔗是一种重要的糖料作物,虫害对甘蔗产量造成了巨大的损失。Bt抗虫基因具有广谱杀虫性,培育转Bt基因抗虫品种为防治甘蔗虫害提供了新的思路。在作物的转Bt基因抗虫育种中,应用最多的一类Bt杀虫蛋白是Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac,这三种毒素的同源性比较高,它们在受体类钙粘蛋白上具有不完全重叠的同一结合位点,昆虫对这三种毒素具有较强的交互抗性,因此Cry1A毒蛋白难以适应抗性管理的需要。作为第二代杀虫基因,Cry2A基因与Cry1A基因的同源性低,在昆虫刷状粘膜上结合位点不同,能够更加特异地结合靶位点,有助于改善靶标类群害虫对Bt抗虫基因产生抗性。为了鉴定Cry2A基因对甘蔗虫害的防控效果,本研究对甘蔗主栽品种进行了Cry2A基因的遗传转化,并对转基因甘蔗株系进行了初步的抗虫性鉴定。本课题主要研究结果如下:（1）成功构建了由玉米Ubi启动子驱动的Cry2A基因高效植物表达载体Cry2A-3300,并通过酶切及测序对载体进行鉴定,确保可用于遗传转化。（2）通过农杆菌介导法对甘蔗胚性愈伤组织进行遗传转化,经过筛选培养及再生培养一共得到46株抗性植株。（3）对抗性植株进行PCR扩增检测,有25株植株呈阳性,阳性率为54%。（4）对阳性植株进行Southern Blot检测,均能检测到杂交信号,证明外源基因Cry2A成功整合进甘蔗基因组,拷贝数1-4个。（5）对阳性植株进行反转录RT-PCR检测,所有阳性植株外源基因Cry2A在转录水平上得到有效表达。（6）再对以上植株进行荧光定量（RT-qPCR）分析,发现Cry2A基因在不同转基因株系之间的表达具有差异性,Cry2A-2这个株系的Cry2A基因表达量最高,较低表达量株系高出12.35倍。（7）对获得的转基因植株进行ELISA分析,发现不同株系间蛋白表达也具有一定的差异性,Cry2A-2这个株系的Cry2A蛋白表达量最高,较低表达量株系高出12.72倍。ELISA的结果与RT-qPCR的结果具有正相关性。（8）对转基因植株进行室内抗虫生测,以生长期一致的棉铃虫幼虫作为实验对象,喂食添加转基因植株叶片的饲料,发现Cry2A基因可显著抑制棉铃虫幼虫的的生长发育。通过对比RT-qPCR、ELISA以及室内抗虫鉴定的结果,发现Cry2A基因表达量不同的植株抗虫性也不同,植株表达量越高,该株系抗虫性越强。
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