产甘油二酯内生真菌的筛选和稻壳基可发酵糖的制备与应用

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甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)是油脂中的天然成分,但其在天然动植物油脂中的含量很低。作为一种结构脂质,与甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)相比,其热量值更低,可作为脂肪替代品添加到食品中,达到降低食物的热量的目的,而且不会破坏产品原本的质地和感官属性。传统的生产DAG的方法如化学法和酶法都存在一些弊端,包括化学法的能耗高、副产物多、以及酶法的成本高、反应速率低和稳定性差等,这些都在一定程度上限制了DAG的商业化生产。因此亟待开发一种新的DAG生产方法,以解决上述问题。利用微生物产油具有占地少、生产周期短、油脂产量高等优点,且丝状真菌由于更容易被收获(呈丝状或小球状生长),因此与其他产油微生物相比具有更大的优势。此外,我国是世界上重要的稻米生产国,稻壳是稻米加工的主要副产物之一,含有可用于制备可发酵糖的半纤维素和纤维素,因此以稻壳为原料制备可发酵糖并用来发酵其它重要化学物质具有重要发展前景。本研究从产DAG内生真菌的分离、筛选与鉴定,发酵条件对内生真菌生长、油脂的积累、产DAG的影响,稻壳基可发酵糖的制备和产DAG内生真菌对稻壳基可发酵糖的利用情况等方面展开工作,主要内容和结论如下:1、从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)植物组织中共分离出43株内生真菌,有5株能够积累DAG的油性真菌。对这5株内生真菌进行了形态学鉴定和分子生物学鉴定,它们分别隶属于五个不同的属:青霉属真菌(Penicillium cataractarum,菌株编号MLGP11,P.cataractarum MLGP11)、镰刀菌属真菌(Fusarium annulatum,菌株编号MLP41,F.annulatum MLP41)、拟盘多毛孢属真菌(Pestalotiopsis scoparia,菌株编号MLY31W,P.scoparia MLY31W)、木霉属真菌(Trichoderma dorotheae,菌株编号MLG23,T.dorotheae MLG23)和刺盘孢属真菌(Colletotrichum aeschynomenes,菌株编号MLY23,C.aeschynomenes MLY23)。脂肪酸组成分析表明5株内生真菌DAG主要脂肪酸组成为油酸(C18:1)、棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)和硬脂酸(C18:0),其中油酸为最主要的不饱和脂肪酸,P.scoparia MLY31W的1,2-DAG的不饱和脂肪酸含量最高,达到了68.98%。2、以生物量、油脂产率和DAG产率为评价指标,通过发酵条件优化确定了产DAG内生真菌的最优发酵条件。对于发酵时间,F.annulatum MLP41、T.dorotheae MLG23和C.aeschynomenes MLY23发酵5d时获得最大DAG产率,P.scoparia MLY31W发酵7d时获得最大DAG产率,P.cataractarum MLGP11发酵9d时获得最大DAG产率;接种量均为3块菌块/100mL培养基时获得最大DAG产率;发酵温度均在28℃时获得最大DAG产率;摇瓶转速均在120rpm时获得最大DAG产率;对于碳/氮(C/N)比(g/g),F.annulatum MLP41和T.dorotheae MLG23在碳氮比为38:1时获得最大DAG产率,C.aeschynomenes MLY23和P.cataractarum MLGP11在碳氮比为68:1时,P.scoparia MLY31W在碳氮比为98:1时分别时获得最大DAG产率。在最优发酵条件下,C.aeschynomenes MLY23菌株的DAG产率达到了189.87mg/L,是5株内生真菌中最高的,油脂产率达到了1.85g/L,其油脂的DAG含量达到了10.26%,生物量达到10.03g/L。3、以H2SO4为催化剂,在高压反应釜中进行两阶段稀酸催化反应稻壳制备可发酵糖。最佳反应条件为:第一阶段稀H2SO4浓度1.5wt%、反应温度140℃、保留时间0min,此时还原糖得率为40.5mol%;第二阶段稀H2SO4浓度4.5wt%、反应温度160℃、保留时间30min,此时还原糖得率为28.0mol%;总还原糖得率达到68.5mol%。采用复合脱毒手段脱除水解副产物,其中甲酸的脱除率达到了45.3%,乙酸的脱除率达到了48.0%,乙酰丙酸的脱除率达到了61.2%,5-羟甲基糠醛的脱除率达到了75.4%,糠醛的脱除率达到了100.0%,总酚的脱除率达到了99.3%。经FT-IR、SEM分析发现,采用两阶段高压反应釜稀酸水解能够有效水解稻壳中的纤维素和半纤维素。通过煅烧稻壳两阶段酸水解后的残渣制备了纯度高达98.0%的无定型二氧化硅。最后以稻壳水解并脱毒后获得的糖为碳源,在最优发酵条件下利用C.aeschynomenes MLY23菌株发酵生产DAG,生物量达9.21g/L,油脂产率达1.51g/L,DAG产率达143.70mg/L,结果接近单独以葡萄糖作为碳源进行发酵时。表明稻壳水解物在内生真菌发酵生产DAG方面有应用潜力。
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