负载纳米氧化锌的壳聚糖温敏水凝胶的制备及体外抑菌研究

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目的:制备负载纳米氧化锌(Zinc oxid nanoparticles,ZnO-NPs)的壳聚糖/β-甘油磷酸钠(chitosan/β-glycerophosphate,CS/β-GP)复合凝胶,对其基本理化性质、体外抑菌性及生物学特性进行初步评价,并评估其用于预防和治疗种植体周围炎的潜在作用。方法:1.利用扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy,SEM)及透射电子显微镜(Transimission electronic microscopy,TEM)对ZnO-NPs进行表征。常温下制备CS/β-GP温敏水凝胶,根据ZnO-NPs与CS的质量分数比,制备1%、3%和5%的ZnO-NPs/CS/β-GP。以CS/β-GP温敏水凝胶为对照组,采用试管倒置法、SEM、傅里叶变换红外光谱(Fourier-transform Infrared spectroscopy,FTIR)考察不同含量ZnO-NPs的加入对水凝胶成胶时间、p H、化学结构及微观形态的影响。2.通过抑菌圈法和菌落计数法检测水凝胶对游离牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)的抑菌能力。通过细菌活/死荧光染色法和SEM观察细菌形态研究水凝胶的抑菌机制。进一步通过结晶紫染色法和MTT法观察各组水凝胶对生物膜生物量及代谢活性的影响。采用CCK-8法和细胞活/死荧光染色法检测各组水凝胶对牙龈成纤维细胞(L929)的细胞毒性及细胞形态的影响。结果:1.ZnO-NPs于TEM下呈现为无规则形状的纳米颗粒,其尺寸为20-30nm。CS/β-GP和ZnO-NPs/CS/β-GP在室温下均具有可注射性,在体温(37℃)下均可以快速响应发生胶凝,且凝胶成胶的时间随着ZnO-NPs含量的增加逐渐缩短,其中5%ZnO-NPs/CS/β-GP成胶的时间仅为(1.19±0.14)min。各组凝胶p H在6.8~7.3之间,均在中性范围。ZnO-NPs/CS/β-GP凝胶的降解率明显低于CS/β-GP凝胶,凝胶更稳定且强度更高。各组凝胶于SEM下均为相互贯通的多孔网状结构,ZnO-NPs的加入未引起凝胶微观结构的变化,且可观察到纳米颗粒均匀镶嵌在水凝胶孔壁中。与CS/β-GP相比,复合水凝胶的红外光谱没有产生明显的新吸收峰,但在3421cm-1处伸缩缝增强且向低波数移动,这表明凝胶的分子间氢键相互作用增强。2.各组水凝胶对P.gingivalis均具有良好的抑菌活性,抑菌效率随着ZnO-NPs含量增加而提高(P<0.05),其中3%、5%ZnO/CS/β-GP的抑菌率均接近100%。此外,1%、3%和5%ZnO-NPs/CS/β-GP的抑菌圈直径分别为16.4、14.9和11.7mm,均明显大于CS/β-GP的抑菌圈直径(8.9mm)(P<0.05)。电镜结果显示CS/β-GP处理过的细菌部分细胞膜边缘破坏;ZnO-NPs/CS/β-GP处理过细菌存在明显塌陷,边缘粗糙呈锯齿状,其对细菌的形态和细胞膜完整性的破坏比CS/β-GP明显。另外,3%和5%的ZnO-NPs/CS/β-GP能显著抑制P.gingivalis生物膜形成和清除已形成的生物膜,且与CS/β-GP组水凝胶相比显著差异(P<0.01)。牙龈成纤维细胞于各组凝胶浸提液中培养24、48、72h后细胞存活率均在90%以上,毒性等级=I级,各组水凝胶对L929细胞均无明显细胞毒性。在倒置荧光显微镜下,与各组凝胶共培养成纤维细胞均呈纺锤状轮廓,具有良好的铺展形态,且细胞几乎呈现绿色荧光,表明各组凝胶均具有良好的生物相容性。结论:本实验制备的ZnO-NPs/CS/β-GP复合水凝胶具有稳定的理化性能和抑菌性能,能抑制P.gingivalis生物膜的形成,且具有较低的细胞毒性,能以溶液形式注入牙周袋并迅速转化为凝胶,操作简单便捷,有望作为临床预防和治疗种植体周围炎的辅助药物。
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