论文部分内容阅读
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)是由细菌合成的大分子脂类聚合物,是细菌在碳源充足而其他营养条件缺乏时积累的碳源和能源物质。它不仅增加了细菌对环境的适应能力,还因其生物可降解性和再生性等优点,成为最有可能替代石油化工塑料的生物材料。芳香族聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyphenylalkanoate,PHPhA)是带有芳香基侧链的一类PHA,与传统塑料聚苯烯的化学结构最为接近,具有较大潜力且目前发现的种类较少。本课题一方面探究PHA合成对微生物降解芳烃化合物的影响,认识PHA合成与细菌代谢的联系。另一方面,改造微生物中芳烃化合物的代谢途径,构建新的PHA合成途径,合成新的PHPhA。 论文通过比较Cupriavidus pinatubonensis JMP134、菌株JMP134△phaC1(PHA合成酶1敲除菌)和菌株JMP134AphaC2(PHA合成酶2敲除菌)在PHA合成、细菌的生长速率、细菌降解2,4-二氯苯氧乙酸(2.4-D)的能力、基因tfdA(编码的双加氧酶催化2.4-D降解为2,4-二氯苯酚,是细菌降解2.4-D的第一个酶蛋白)转录表达四个方面,来探究PHA合成对细菌降解2,4-二氯苯氧乙酸的影响。以2,4-D为唯一碳源生长,野生型菌株JMP134的PHA合成酶能发挥功能合成PHA,但敲除菌株JMP134△phaC1和JMP134△phaC2不能合成PHA。细菌生长曲线和细菌降解2.4-D的曲线表明野生型菌株JMP134的生长速率比两株敲除菌株要快,而且降解2.4-D的速率也要快。tfdA基因的转录水平结果显示野生型菌株JMP134明显比敲除菌株JMP134△phaC1和JMP134△phaC2要高。PHA合成影响了菌株中2,4-D降解的蛋白表达和调控,从而影响到细菌对2,4-D的降解能力。通过以上实验结果证明,PHA合成能影响菌株JMP134降解2,4-D的能力。 论文还初步改造了Acinetobacter sp.strain ADP1中对香豆酸降解途径,构建新的PHA合成途径合成新型PHPhA。首先通过信息学分析和GC-MS检测,确定菌株ADP1中不含有合成PHA相关的基因且不能合成PHA。敲除菌株ADP1的hcaA基因,敲除菌ADP1△hcaA不能以对香豆酸为唯一碳源进行生长。然后引入外源的参与合成PHA相关的酶基因,如:phaJ4Pa(编码的PhaJ4能识别中长链PHA的底物),phaJ3Pa(编码的PhaJ3具有广泛底物谱),phaC1Pp(编码的PhaC1能合成PHPhA)。将上述基因导入细菌ADP1△hcaA中,检测菌株PHA生成情况。虽然目前没有得到预想结果,但用基因工程的手段探寻新的PHPhA作的尝试和经验,为PHA合成作了思想上的突破和证明,而这种新的寻找新型PHA种类的方法,依旧可以从其他的菌株和物质代谢中去探寻合成新的PHA的可能性。 本论文进行了PHA合成与Cupriavidus pinatubonensis JMP134和Acinetobacter sp.strain ADP1芳烃代谢关系的研究。证明在菌株JMP134的代谢过程中,PHA合成影响细菌对2,4-D的降解能力,说明了PHA合成对细菌代谢流的影响,对人类改造微生物处理芳烃污染物有重要指导意义。同时初步探究在菌株ADP1中,通过改造对香豆酸的代谢途径来寻找新的PHPhA。用新的PHA的合成方法合成更为接近石油化工塑料的PHPhA,对于获得能替代不可降解塑料的新型材料,增加PHA的工业应用具有意义。