基于激光的DNA甲基化高分辨率熔解曲线分析

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基因是控制生物形态的基本遗传单位,对生物的基本性状起着决定性作用,储存着生物在生命过程中的全部信息包括生物的种族、生理结构、孕育、生长、凋亡等过程。基因的变异是指构成基因的碱基对序列发生了改变,基因的变异通常会对生物产生非常严重的后果,轻则导致疾病重则造成生物的死亡。DNA的甲基化便是众多基因突变中的一种,DNA的甲基化是一种可以保证DNA序列不被改变的前提下改变其对应的遗传表现,在近年来的大量研究中,人们发现DNA的甲基化会造成染色体空间结构和DNA双链构象的改变,进而影响到DNA双链结构的稳定性,也会影响到染色体中DNA双链和蛋白质之间的相互关系,最终控制基因的表达。DNA的甲基化程度与胚胎的正常发育、人类恶性肿瘤的出现有着重要联系。所以,从基因层面上检测DNA序列是否发生了甲基化以及甲基化的程度可以更早、更加准确的发现疾病,甚至可以做到对疾病的预防。本课题主要在高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melting,HRM)方法的基础上,结合了法布里-玻罗型微腔以及光微流激光技术,使用了基于激光的高分辨率熔解曲线分析方法来检测分析DNA的甲基化。本课题中主要检测分析了四种不同程度的DNA甲基化以及五种不同浓度DNA甲基化。首先,我们通过理论分析了基于激光的HRM,探究了基于激光的HRM与基于荧光HRM之间的不同以及其优势。然后我们对长度为30个碱基对、拥有3个甲基化点位的四种不同程度的甲基化DNA样品和五种不同浓度的甲基化DNA样品进行了检测实验。实验结果表明,利用基于光微流激光的HRM可以清晰的区分出未甲基化DNA、两种类型的保留甲基化DNA以及从头甲基化DNA,未甲基化DNA熔解温度与一型保留甲基化之间有着4℃左右的差异,两种类型的保留甲基化之间有着1℃左右的差异,二型保留甲基化与从头甲基化也有着4℃左右的差异。此外,我们还基于激光的独特性质开发出另外一种更加简洁的检测方法,即在某一恒定温度下使用不同的泵浦能量扫描样品,比较不同样品泵浦能量-输出光强拟合直线来进行区分。实验结果表明,使用这种方法可以清晰的区分开四种不同程度的甲基化DNA样品以及五种不同浓度的甲基化DNA样品,这是基于荧光的HRM所无法实现的。
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