变态发育是动物界普遍存在的现象，它是动物在胚后发育过程中，形态在短时间发生剧烈的变化，同时动物的组织结构和生活习性上也出现一系列显著的差异性改变，这种胚后发育就是变态发育。两栖动物属于脊椎动物中由水生到陆生的过渡类群，大部分需要经变态才能登陆生活。两栖动物的胚后发育过程是最为经典的变态发育的例子，研究两栖动物变态发育对脊椎动物的进化和个体发育的认识都具有重要的科学意义。当前对于两栖动物变态发育的分子机制研究主要还是集中在模式动物非洲爪蟾Xenopus laevis或者热带爪蟾Xenopus tropicalis，研究发现变态发育是由甲状腺激素(Thyriod Hormone，TH)与甲状腺激素受体α(TRα)结合来调节一整套基因的表达，这也包括调控TRβ的表达，从而启始变态发育。非洲爪蟾和热带爪蟾隶于古蛙类，从它们的研究中发现的这一变态发育调控体系在无尾两栖动物变态发育中是否具普适性尚不清楚。此外有研究报道TRα敲除或敲低的热带爪蟾突变体中，变态发育过程仍然能够发生，只是突变后的热带爪蟾比野生型个体到达变态期的时间更短，并且拥有较小的个体。这暗示着TRα开启两栖动物变态发育的分子模型可能不完整，同时TRα基因能够调节到达变态发育的时间以及个体的大小。因此，本研究选择隶于新蛙类的饰纹姬蛙Microhyla fissipes作为研究对象，基于其3个关键发育阶段(变态早期(premetamorphosis，PM)、变态高峰期(metamorphic climax，MC)和变态结束（completion of metamorphosis，CM））转录组测序分析进行变态发育机制是否具有普适性。同时由于变态发育的过程也是栖息环境改变的过程，我们也分析了两种不同的栖息环境下动物差异表达的基因，以期在其中找到适应陆生环境生活的基因。根据测序和计算机计算的结果，我们随机挑选6个不同表达趋势的基因(col2a1、cola1、myl10、myl2、gngt1和them4)进行相对荧光定量PCR来验证转录组数据的可靠性。同时我们也对TRα和TRβ基因在三个阶段的表达水平采用绝对荧光定量PCR的方式做了进一步的验证。为验证TRα基因在热带爪蟾中的功能是否在其他物种中同样存在，本实验在相同的实验室环境下饲养了中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）、饰纹姬蛙和非洲爪蟾三个物种，并观察记录胚胎发育过程中发育时间和个体大小来观察记录动物的表型，同时，通过相对荧光定量PCR技术比较了中华大蟾蜍和饰纹姬蛙TRα和TRβ两个基因在变态发育早期的表达的水平，以期观察表型和基因型之间的联系。　　主要结果如下:　　1)饰纹姬蛙变态发育关键阶段的转录组及差异基因分析　　三个阶段的转录组测序结果总共获得约18G bp的数据。去除冗余片段、接头和测序质量不好的片段，最终得到177，585，214bp的数据，通过Trinity软件组装共得到177，473个转录本和110，061条基因。通过组装结果与6个数据库(NCBI非冗余蛋白数据库Nr，NCBI非冗余核酸数据库Nt，Swiss-Prot数据库，真核生物直系同源群KOG，基因本体数据库GO和京都基因与基因组百科全书KEGG)的比对，共被注释得到34，934个基因。三个阶段两两比较发现有1，181个基因上调和1，400个基因下调。通过log2FC值来统计差异基因的差异倍数，我们发现普遍差异都在2-8倍，而差异倍数大于16倍的基因较少，我们将2-8倍区间的基因进行KEGG富集分析，发现细胞外基质和受体交互(ECM-receptor interaction)在变态发育高峰期活跃，且富集到通路的基因集发现细胞外基质(ECM)相关基因表达量高，ECM和细胞之间的联系较为活跃;同时，根据差异倍比排序，前十个差异表达基因除与代谢有关以外，还与胃肠形成以及肺和胃肠行使功能相关;通过层次聚类和自组织神经网络映射聚类的方式结果依然发现细胞外基质(ECM)相关基因在变态高峰期高表达，这样的结果暗示细胞外基质相关基因是变态发育能够顺利进行的必要因素。此外，通过自组织神经网络映射聚类还发现了原癌基因和生长激素受体相关基因在变态发育早期高表达，相反抑癌相关基因却在变态发育结束高表达，这些基因的发现都为变态发育不同阶段的表型现象提供了分子依据。　　2)饰纹姬蛙中陆生适应性的基因挖掘研究　　两栖动物是脊椎动物中从水生开始向陆生过渡的一个类群，饰纹姬蛙蝌蚪完成变态前适应水生生活，而变态结束后饰纹姬蛙幼蛙开始在临近水边的陆地生活。换言之，饰纹姬蛙通过变态发育完成了从水到陆的蜕变。本研究中我们将变态发育早期和变态结束两个阶段的转录组进行比较分析，发现748个上调基因和919个下调基因，我们将这1，667个差异表达基因进行GO功能富集分析，在富集的20类生物学过程(GO-BP)，20类分子功能（GO-MF）和20类细胞组件(GO-CC)中，我们重点关注了两簇功能基因:血红蛋白复合物和眼睛晶状体的结构组成。结果发现5个血红蛋白基因的表达量随着变态的结束急剧下降，这反映饰纹姬蛙从鳃呼吸转变成肺的呼吸，大大提高了对氧气的摄入量，同时空气的氧气浓度比水中的溶氧高，动物通过载氧蛋白基因的表达量相应降低来适应这一改变。对于眼睛晶状体的结构组成，我们也发现10个与眼睛晶状体的结构组成相关的基因上调，这也从基因水平揭示了饰纹姬蛙通过对感觉器官的完善来应对陆生环境的多样性。此外，我们也检测到3个跟尿素循环相关酶的基因表达量极速上升，饰纹姬蛙通过提高尿素循环相关酶的基因的表达量来排出氮代谢废物。这些基因的挖掘为两栖动物适应陆生环境提供分子基础。　　3)甲状腺激素受体α(TRα)的功能保守性研究　　研究报道TRα基因被敲低或者敲除后的热带爪蟾依然能够进行变态发育，只是加速了到达变态发育的时间以及缩小了个体的大小，这暗示了在热带爪蟾个体中低表达或者不表达TRα能够加速热带爪蟾到达变态发育的时间，并且缩小个体的大小。这意味着热带爪蟾个体中TRα基因水平可能调控到达变态发育的时间和个体大小。为验证TRα基因在热带爪蟾中的功能是否具有保守性，本研究在实验室环境下饲养3种无尾目物种的受精卵（饰纹姬蛙、非洲爪蟾和中华大蟾蜍），并且对他们按照形态特征进行变态时间和个体大小的测量。结果显示，饰纹姬蛙需要21天到达变态启始，而中华大蟾蜍需要29天，非洲爪蟾需要30天。此时，饰纹姬蛙个体最小，18.0±0.3mm(n=7)，中华大蟾蜍和非洲爪蟾个体相对更大，分别是21.2±0.4mm(n=7)和35.9±0.5mm(n=7)。同时，饰纹姬蛙的平均增长率为0.7mm/天，而中华大蟾蜍是0.6mm/天。根据相对荧光定量PCR数据显示，饰纹姬蛙在变态发育早期TRα的表达量低于TRβ，而非洲爪蟾和中华大蟾蜍却是TRβ的表达量低于TRα，呈现了相反的结果。高表达TRα的非洲爪蟾和中华大蟾蜍较低表达TRα的饰纹姬蛙个体有较长到达变态发育的时间，且拥有较大的个体。这些证据共同支持甲状腺激素检测不到的变态发育早期，高表达的TRα可以延缓个体到达变态发育的时间以及增加个体的大小的功能。这暗示TRα对两栖动物无尾目有延缓个体到达变态发育的时间以及增加个体的大小的功能。　　4)启动变态发育的调控因子研究　　研究发现在非洲爪蟾模型中变态发育是受甲状腺激素与甲状腺激素受体α和β结合的调控，其通过调节一系列基因的活动而调控非洲爪蟾的变态发生;也就是说甲状腺激素受体做为应答甲状腺激素的调控因子来启始变态发育，但是TRα敲除后的热带爪蟾依然能够进行变态发育。在本研究中，转录组数据和绝对荧光定量PCR技术数据都一致显示饰纹姬蛙是一个天然TRα基因敲低的物种，饰纹姬蛙TRα的表达量在三个阶段均表现极其低，但我们发现了一个一致的规律是，热带爪蟾、非洲爪蟾、饰纹姬蛙、黑斑蛙Pelophylax nigromaculata、库奇掘足蟾Scaphiopus couchii、墨西哥旱掘蟾Spea multiplicata、强刃锄足蟾Pelobates cultripes，甚至是突变TRα的热带爪蟾X.tropicalis都在变态发育过程中TRβ基因都呈现出较高的表达量，且在变态发育高峰期都呈现出了TRβ基因的表达量峰值，这些结果提示TRβ可能是启动变态发育必不可少的转录因子。　　5)两栖动物变态发育分子机制分析与讨论　　利用非洲爪蟾和热带爪蟾对两栖动物研究变态发育的分子机制中，甲状腺激素缺乏的变态发育早期，甲状腺激素受体可以募集到抑制复合物，这些抑制复合物使得结合位的组蛋白去乙酰化，去乙酰化染芭质和组蛋白结合得更加紧密从而抑制基因的表达。随着甲状腺激素的积累，甲状腺激素受体与甲状腺激素集合，可以募集到激活复合物，这些激活复合物使得结合位的组蛋白乙酰化，乙酰化染色质和组蛋白结合的松散使得下游基因转录。然而，TRα被敲除后的热带爪蟾依然能够进行变态发育，暗示在热带爪蟾中TRα可能不是变态发育的开关基因。本研究发现饰纹姬蛙的3个发育关键阶段的TRα都处于一个低表达的水平，不同的是，TRβ跟非洲爪蟾有着一样的表达模式，呈现出增高再降低的趋势（变态高峰期表达量最高），这些都暗示了至少在饰纹姬蛙的变态发育中TRβ可能才是调节变态发育的开关基因。根据与甲状腺激素相关的基因表达情况，我们在本研究中提出了开启两栖动物变态发育的分子模型。通过TRs调节变态发育的启始是多步骤且复杂的过程，热带爪蟾中，在甲状腺激素缺乏的情况下，TRα/RXRs对TRβ的表达量进行抑制，而当甲状腺激素积累，结合甲状腺激素的TRα/RXRs对TRβ的抑制作用取消，TRβ累计到一定水平时激活变态发育过程;饰纹姬蛙中，由于TRα/RXRs的表达量极低，对TRβ的表达几乎无抑制作用，当甲状腺激素积累到较高阈值时，TRβ/RXRs激活下游基因，开启变态发育。