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研究背景:骨质疏松症（OP）是一种以骨量减少为特征的代谢性骨骼疾病,严重降低患者的生活质量。现有研究表明,骨质疏松的发病因素与破骨吸收和成骨分化所维持的骨稳态失衡有关。近年来,治疗骨质疏松症的药物种类繁多,主流的药物大多从两个方向发挥作用即:抑制破骨吸收过程或促进成骨形成过程。然而,其严重的副作用和价格等问题仍使其有待寻找更优的解决方案。自噬过程对真核细胞的生理活动有着至关重要的作用。自噬是以自噬体的工作为起点。自噬体首先将细胞器、细胞内的病原体及蛋白类物质包裹,随后自噬体发挥了自身的转运作用。将上述物质运输至溶酶体,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体。自噬溶酶体中包裹的细胞器、细胞内的病原体及蛋白类物质被降解后,其分解产物被再次循环利用。自噬目前存在三种形式:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。在整个自噬这一大的研究领域中,巨自噬扮演了重要角色,同时也是最主要的形式。巨自噬是本文的研究重点。其作用形式是将细胞的内质网和高尔基体膜拉长,包裹特定有害物质形成自噬体。自噬体转运有害物质并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,自噬溶酶体通过体内水解酶的作用下将包裹的大分子有害内容物分解,从而形成能够被细胞重新利用的小分子物质。近年来的自噬相关研究表明,自噬能够调控多种生理与病理现象的发生与发展,包括衰老、肿瘤、内分泌疾病以及骨骼系统疾病。PMAIP1（Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1,佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1）是一种凋亡家族基因并与DNA损伤有关,然而PMAIP1与巨自噬和骨质疏松的关系尚不明确。本文希望通过研究来明确PMAIP1与巨自噬和骨质疏松的关系,从而发现其中的调控机制,为未来骨质疏松的治疗寻求新的位点。方法:1.通过生物信息学分析GEO数据库的GSE62402从而寻找骨质疏松的关键基因。通过基因热图与火山图筛选骨质疏松的潜在高危因子。Metascape用于进行GO富集分析基因富集的区域。GTBA用于进行GSEA分析进一步分析单独基因PMAIP1的相关性,从而探讨其生物学功能和可能的作用机制。2.成骨细胞hFOB1.19与破骨细胞HOCCs的细胞培养以及慢病毒转染构建敲减PMAIP1的成骨细胞和破骨细胞为后续的分子生物学研究提供验证基础。3.通过MTT法检测PMAIP1对成骨细胞hFOB1.19与破骨细HOCCs的增殖影响。4.通过对敲减PMAIP1的成骨细胞hFOB1.19进行茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）染色,对敲减PMAIP1破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）以及使用PCR验证敲减PMAIP1后成骨相关标志物ALP、OPN、RUNX-2和敲减PMAIP1后破骨相关标志物TRAP、CTR、Cathepsin K的mRNA水平的表达验证PMAIP1对成骨细胞和破骨细胞的影响。5.利用透射电镜扫描验证敲减PMAIP1的成骨细胞与破骨细胞是否发生了自噬现象。通过对敲减PMAIP1以及使用自噬抑制剂的成骨细胞与破骨细胞的蛋白印迹实验（Western blot）验证PMAIP1与自噬以及自噬相关通路AMPK/mTOR的关系。6.建立大鼠去卵巢骨质疏松模型,随后使用micro-CT和免疫组化进一步在体内验证PMAIP1与骨质疏松和自噬的关系。结果:1.生物信息学分析结果显示PMAIP1是骨质疏松症的高危因素。低BMD患者中PMAIP1显著上调,是骨质疏松症的重要高危因素。上调分子在免疫过程、细胞增殖、代谢过程和分化等生物学过程中发挥重要作用。2.PMAIP1对成骨细胞和破骨的增殖能力的作用存在差异。在敲减PMAIP1后,成骨细胞的增殖能力增强。与之相对的是,破骨细胞增殖能力则明显受到了抑制,并且随着时间的推移,这些现象也更加显著。3.敲减PMAIP1能够促进成骨细胞分化同时抑制破骨细胞功能。成骨细胞的Sh-PMAIP 1组的矿化结节形成明显增多,碱性磷酸酶（ALP）活性明显升高。而破骨细胞中Sh-PMAIP1组的TRAP染色活性显著降低。此外,PMAIP1基因敲除后成骨细胞的成骨相关基因在mRNA水平升高,破骨细胞的破骨相关mRNA水平下降。4.PMAIP1通过调节成骨细胞自噬来促进骨质疏松。对样本进行透射电镜（TEM）分析,发现成骨细胞Sh-PMAIP1组的自噬小体数量增加。然而,在破骨细胞Sh-PMAIP1后自噬小体减少。利用自噬抑制剂维替泊芬（Verteporfin,VP）单独处理成骨细胞和破骨细胞,并与Sh-PMAIP1联合作用。结果显示成骨细胞中,Sh-PMAIP1后自噬作用增强,当Sh-PMAIP1后与自噬抑制剂联合使用时,自噬作用则减弱。然而,在破骨细胞中,各实验组中并未出现明显差异。5.PMAIP1通过调节AMPK/mTOR信号通路抑制成骨细胞的成骨作用。Western blot结果显示,PMAIP1基因敲除后成骨细胞hFOB1.19的AMPK/mTOR相关蛋白改变显著,而在破骨细胞HOCCs中变化不明显。同时,在hFOB1.19细胞中,Sh-PMAIP1组AMPK和p-AMPK表达显著上调。而在HOCCs细胞中,与NC组相比,Sh-PMAIP1组并未出现明显差异。此外,我们还建立了体内去卵巢模型。大鼠骨质疏松模型从组织学评价进一步证实了PMAIP1的促骨质疏松作用。OVX大鼠骨骼中PMAIP1的表达明显高于Sham大鼠骨骼中PMAIP1的表达。结论:我们初步证实了 PMAIPI通过AMPK/mTOR调控自噬来抑制成骨细胞,证明PMAIP1可能成为治疗骨质疏松症的新靶点。