【摘 要】
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胰蛋白酶是一种重要的碱性丝氨酸蛋白水解酶,专一水解精氨酸和赖氨酸的羧基端肽键,具有很强的氨基酸位点特异性。传统方法上,胰蛋白酶原料来源受限、分离纯化困难,且酶活较低。动物性来源的胰蛋白酶携带未知病毒和外源因子等风险,因此动物性来源的胰蛋白酶在药物制备中受到很大限制。本课题利用计算机辅助设计对胰蛋白酶进行定点突变模拟预测,然后通过分子生物学技术构建基因工程菌,来表达获得高活性的重组胰蛋白酶,并将重组
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胰蛋白酶是一种重要的碱性丝氨酸蛋白水解酶,专一水解精氨酸和赖氨酸的羧基端肽键,具有很强的氨基酸位点特异性。传统方法上,胰蛋白酶原料来源受限、分离纯化困难,且酶活较低。动物性来源的胰蛋白酶携带未知病毒和外源因子等风险,因此动物性来源的胰蛋白酶在药物制备中受到很大限制。本课题利用计算机辅助设计对胰蛋白酶进行定点突变模拟预测,然后通过分子生物学技术构建基因工程菌,来表达获得高活性的重组胰蛋白酶,并将重组胰蛋白酶应用于微波-超声协同酶解猪小肠黏膜工艺中,以提取得到高效价的肝素钠。在临床上肝素钠是一种重要的抗凝血药物。相关研究结果具有一定的研究意义和应用价值。本文主要研究内容如下:1.采用计算机软件辅助设计对胰蛋白酶定点突变进行模拟预测。使用CDOCKER分子对接方法确定胰蛋白酶的活性部位,然后应用虚拟氨基酸定点突变方法Calculate Mutation Energy对胰蛋白酶活性位点的突变能进行预测。最终确定了两种突变组合CYS49ILE（-1.34）、SER200ARG（-1.90）作为突变试验目标。2.本试验采用所构建的基因工程E.coli BL21（DE3）宿主表达菌,通过含有卡那霉素的LB培养基培养和乳糖诱导表达重组胰蛋白酶原,并纯化和SDS-PAGE电泳鉴定。通过His标签纯化得到野生型重组胰蛋白酶原、突变型C胰蛋白酶原、突变型S胰蛋白酶原,相应的SDS-PAGE电泳蛋白条带较清晰。3.本试验对重组胰蛋白酶原进行激活,得到相应的重组胰蛋白酶,经过BAEE方法检测酶活:商品胰蛋白酶1694.2±18.3 U/mg,野生型重组胰蛋白酶2570.7±20.7 U/mg,突变型C胰蛋白酶2756.0±15.6 U/mg,突变型S胰蛋白酶2810.3±12.5 U/mg。4.试验采用微波-超声协同酶解提取工艺制备肝素钠,工艺参数为:小肠粘膜50 g,微波100 W处理时间10 min,控制料液比为1:10（g/m L）,在温度为40℃超声40 min,加入重组胰蛋白酶0.5 g,于50℃酶解3 h。按照条件,使用各胰蛋白酶进行酶解,所得粗品肝素钠效价分别为:91.05±1.59 U/mg（商品胰蛋白酶）,97.26±1.43 U/mg（野生型重组胰蛋白酶）,99.31±0.68 U/mg（突变型C胰蛋白酶）,100.57±1.06 U/mg（突变型S胰蛋白酶）。
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