牛白血病病毒(bovineleukemiavirus,BLV)属于反转录病毒科(Retroviridae),丁型反转录病毒属(Deltaretrovims),在分类学上与人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型(HumanT-cell lymphotropic virus type 1,HTLV-1)最为接近。病毒基因组全长8,714 bp,包含gag、pro、pol、env、G3、G4、TAX、RE 等基因以及两侧相同的长末端重复序列(longterminal repeats,LTRs)。该病毒的感染会引起牛淋巴细胞持续性增生(persistentlymphocytosis,PL),从而导致牛地方流行性白血病(enzooticbovine leukosis,EBL)。此外,该病毒也可以感染瘤牛、水牛、绵羊、水豚等,甚至有报道称在乳腺癌患者的乳腺组织中发现了 BLV的核酸片段。有关BLV感染对奶牛生产性能的影响,世界范围内的奶牛业者对此还未有定论。一些基于奶牛群体水平的研究发现BLV的感染会导致产奶量的下降。然而,一些基于小样本、个体奶牛水平的研究却得出了相反的结论。本研究建立了一种灵敏度高、特异性强的BLV分子检测方法,并开展了加勒比地区、中国BLV流行情况分子流行病学调查以及BLV基因型的分析;此外,本研究基于回顾性队列和动物感染实验挖掘BLV的致病性及其感染对奶牛生产性能的影响。具体研究如下:1.检测BLV的FRET-qPCR方法的建立和应用牛地方流行性白血病传统的诊断方法为病理组织学检测,需要将疑似牛进行解剖,采取淋巴结等病变部位进行染色,观察病理变化。血液学检测以外周血淋巴细胞为基础,如果淋巴细胞计数显著升高,且淋巴细胞比例大于60%,则有罹患该病的可能。血清学方法主要针对患病动物血清中抗gp51和p24抗体,分为间接法ELISA和阻断法ELISA。分子生物学检测以BLV的前病毒DNA为目标,由于其灵敏度高、特异性强,并能在全病程检测该病毒的特点而受到人们的青睐。本研究根据GenBank中所有(截至2015年5月)BLV全基因核酸序列,在其pol基因的保守区域设计一对特异性的引物和一对特异性的探针,建立了一种能够在20 μL反应体系中检测到单拷贝病毒核酸的BLV FRET-qPCR方法。该检测方法不仅灵敏度高(单拷贝BLV基因/每个反应体系),而且特异性好,不扩增牛疱疹病毒 1 型(bovine herpesvirus 1,BHV-1)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、牛布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、巴贝斯虫(Babesia spp.)、泰勒虫(Theileriaspp.)、无形体(Anaplasma spp.)等其它常见牛源病原体的核酸。为进一步验证该方法的可行性,我们在某BLV阳性牧场随机采取105头奶牛的血液、阴道分泌物、牛奶和粪便,用上述方法对这些样品进行检测。结果显示,BLV在血液中的检出率最高,其次为阴道分泌物、牛奶和粪便。血液中BLV的拷贝数显著高于阴道分泌物、牛奶和粪便中病毒的拷贝数。基于该方法研制的BLV FRET-qPCR检测试剂盒已经获批国家发明专利授权(专利号:ZL201410597176.X)。2.加勒比海3个岛国BLV的分子流行病学调查及基因分型加勒比地区位于北美洲和南美洲之间,由众多岛屿组成。截至目前,还没有确认BLV核酸在该地区的存在。为了解BLV在加勒比地区的流行情况,我们从Dominica,Montserrat,Nevis和St.Kitts等4个岛屿采集了 325份当地牛全血样品。首先,通过本实验室建立的HBMS核酸质量控制系统对核酸样品进行检测,判断核酸在远距离运输过程中的降解情况。然后,利用本研究建立的BLV FRET-qPCR方法对这些样品进行检测,结果发现Dominica(5.2%;4/77)和 St.Kitts(19.2%;37/193)为 BLV 阳性岛屿,而 Montserrat(n=12)和Nevis(n=43)未发现阳性样品。为了进一步探究加勒比地区BLV毒株的基因型,我们设计引物对其env基因进行扩增、测序和拼接,并构建了基于env基因全长(1,548 bp)和env gp51基因(807bp)的系统进化树(neighbor-joining)。聚类结果表明,加勒比地区的BLV毒株属于genotype 1(相似度99.4%),这是一种在世界范围内流行最为广泛的BLV基因型。我们的研究首次利用分子生物学方法证明了 BLV在加勒比地区的存在,并发现该地区的BLV流行株属于genotype 1。3.我国BLV的分子流行病学调查及该病毒的基因分型BLV的感染由于其病程长、大部分感染病牛不表现典型临床症状,因而并没有得到我国和多数其它国家的兽医主管部门和畜主的重视。然而,少数西欧发达国家,以及澳大利亚和新西兰,从20世纪后半叶就开始对该病毒实施净化,并已经取得了显著成效。近年来,美国农业部组织开展了数次全国范围内BLV流行情况的调查,发现该病毒在美国的奶牛和肉牛中广泛流行。我们认为,摸清该病毒在中国范围内的流行状况也已经刻不容缓。因此,我们在中国19个省采集了 1,963份奶牛和1,390份肉牛的全血样品,运用本研究建立的BLVFRET-qPCR检测方法对这些样品进行检测,并利用商业化的BLV抗体ELISA检测试剂盒对检测结果进行验证。结果表明,BLV在我国广泛流行,其中奶牛的感染率(49.1%,964/1,963)显著高于肉牛的感染率(1.6%,22/1,390),BLV在奶牛(103.57±1.55/mL)血液中的拷贝数显著高于其在肉牛(101.42±1.32/nmL)血液中的拷贝数(P<0.0001),分子学检测方法与血清学诊断方法整体一致率为86.3%。为进一步确认我国所流行BLV的基因型,我们对其env gp51基因进行扩增并构建了系统进化树(neighbor-joining)。聚类结果显示,我国的BLV毒株与genotype 6最为接近(相似度97.9%)。对env gp51基因核酸、氨基酸突变位点的分析表明,盐城株、上海株、蚌埠株相似度较高,扬州株、天津株相似度较高。该研究首次在国际期刊上报道了我国BLV的流行情况。4.BLV感染对奶牛生产性能的影响:基于回顾性队列的研究以上研究表明,BLV在我国的奶牛中广泛流行,且病毒在奶牛血液中有着较高的拷贝数。同时,BLV潜伏期长、发病晚,这又与奶牛饲养周期长的特点相吻合。因此,BLV感染对奶牛生产性能的影响值得我们深入研究。为了探索BLV感染对奶牛产奶量和乳品质量的影响,我们选择上海某BLV阳性牧场进行回顾性研究。我们先后两次采集该牛场荷斯坦奶牛全血样品,两次采样的间隔时间为一年。通过本研究建立的BLV FRET-qPCR方法以及本实验室先前建立的分子学检测方法,筛选出这两个采样时间点BLV感染状态一致,且未感染泰勒虫病(theileriosis)、无形体病(anaplasmosis)和埃立克体病(ehrlichiosis)的655头奶牛,其中81.7%为BLV阳性牛(n=535),18.3%为BLV阴性牛(n=120)。分别根据胎次(1胎:n=239,2胎:n=166,3胎:n=94,4胎及以上:n=156)和泌乳期(泌乳前期:n=290,泌乳中期:n=254,泌乳后期:n=111)对这些奶牛进行分组,分析BLV感染对不同胎次或泌乳期奶牛产奶量和体细胞评分的影响。结果显示,4胎及以上的奶牛中,BLV的感染对导致其泌乳前期、泌乳中期产奶量的显著降低(前期:26.8vs.30.9kg,下降13.2%,P=0.0002中期:22.2vs.26.1kg,下降14.9%,P=0.0002)和体细胞评分的显著升高(前期:5.2vs.4.3,P<0.0001;中期:4.9vs.3.9,P=0.0002)。其它胎次的奶牛中,BLV的感染对各泌乳期的产奶量和体细胞评分无显著影响。5.BLV的致病性及其感染对生产性能的影响:基于奶牛感染模型的研究为了进一步探明BLV感染对奶牛产奶量、牛奶体细胞评分、奶牛血常规、免疫相关细胞因子、外周血白细胞转录组的影响,以及病毒在奶牛各种脏器和分泌物中的分布情况,本研究建立了 BLV奶牛感染模型。在某BLV阴性奶牛场挑选遗传背景相似、胎次相同(1胎)、生产性能接近的30头奶牛,随机分成BLV感染组和对照组,每组15头奶牛。感染前,检测所有实验牛的血常规指标(18项),测定10种免疫相关细胞因子(GM-CSF、IFN-γ、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13),收集所有实验牛第一胎产奶量、DHI(乳脂率、乳糖率、蛋白率、体细胞数)。统计分析表明,以上所有检测指标在两组奶牛之间无显著差异。感染后,将两组奶牛隔离饲养,所有饲养条件均相同。分子学检测结果显示,感染后Od(感染后2h),感染组6头奶牛的外周血液被检测到BLV核酸;感染后5 d,感染组6头奶牛的外周血液被检测到BLV核酸,其中5头阳性奶牛和感染后Od检测结果一致;感染后15 d,感染组所有奶牛的外周血液都被检测到BLV核酸。感染后45 d、75 d、105 d、135 d、165 d的检测结果与感染后15 d的检测结果一致。而血清学检测结果显示,直到感染后45 d,才能在感染组奶牛血清中检测到BLVgp51蛋白抗体。对两组奶牛BLV感染后8个月内的生产性能(产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、体细胞评分)进行统计分析,我们发现,与对照组相比,感染组奶牛日平均产奶量(33.00±8.42 vs.32.45±8.18,kg,升高 1.67%,P=0.03)和乳脂率显著提高(4.45±1.40vs.3.88±1.04,%,P=0.02),其它DHI指标无显著性差异。感染后,感染组奶牛出现了明显的炎症反应,且炎症反应主要集中在感染后15-45 d,从以下两方面可以体现:1、血常规。感染后,多项血常规指标(白细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞比例、单核细胞比例、中性粒细胞比例、血红蛋白、红细胞压积、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板、血小板分布宽度)在不同时间点出现了显著性变化(P<0.05)。值得注意的是,白细胞、淋巴细胞、单核细胞都在感染后5 d下降,感染后15 d、45 d升高,此后趋于平稳。2、炎症相关细胞因子。细胞因子表达水平的差异主要集中在感染后15d,在该时间点,与对照组相比,感染组奶牛IFN-γ(75,794.73±42,529.12vs.41,065.30±25,216.67,pg/mL,P=0.01)、IL-10(108,555.82±50,554.92 vs.69,994.84±39,582.16,pg/mL,P=0.03)、IL-12p70(4,304.16±2,483.99 vs.2,306.02±779.66,pg/mL,P=0.008)的表达水平显著升高;感染后165d,与对照组相比,感染组奶牛 IL-12p70(3,791.58± 1,200.86vs.2,926.13±711.69,pg/mL,P=0.05)的表达水平显著升高。外周血白细胞转录组WGCNA分析发现,经过相关性模块筛选,我们得到感染组奶牛在感染后15 d显著上调的12个差异表达基因,其中7个基因(RECQL4、KIFC1、CDC20、DTYMK、NCAPH、UBE2C、MKI67)与癌症的发生和发展显著相关。这些基因在BLV感染中所发挥的作用值得我们进一步探究。为了解病毒在奶牛组织脏器中的分布情况,我们对部分实验牛进行了剖解,利用本研究所建立的BLVFRET-qPCR检测方法,对感染牛血液、肌肉、关节液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃、空肠、乳腺、卵巢以及各类淋巴结进行检测。结果显示,除了小肠和卵巢,BLV在其它组织脏器中均有分布。其中,病毒在血液和脾脏中的拷贝数显著高于在其它组织脏器中的拷贝数。本研究建立了 BLV FRET-qPCR检测方法,并应用该方法进行了加勒比地区和中国的BLV分子流行病学调查和基因型分型,基于回顾性队列研究和感染模型探索了 BLV对奶牛生产性能及血常规、免疫相关细胞因子、外周血白细胞转录组的影响,并对病毒在奶牛体内的分布进行了研究。我们的研究为BLV的检测、溯源、致病性以及净化策略提供了理论依据。