[研究背景]肾癌(renal cell carcinoma, RCC)是常见的泌尿系恶性肿瘤,其发病率位居泌尿系肿瘤的第二位,仅次于膀胱癌,占全身恶性肿瘤的3%。肾癌的组织分型中以肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)最为多见,约占80-85%。目前对于早期肾癌,根治性肾切除的治疗效果确切,但对于已发生浸润转移的晚期肾癌患者或术后复发转移患者仍缺乏十分有效的治疗手段,其5年生存率均低于9%。既往的研究表明,RCC的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,其中涉及众多的癌基因、抑癌基因和生长因子的激活或异常表达。因此,阐明RCC发生发展的分子遗传机制并在此基础上探索新的早期诊断和治疗方法具有重要意义。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类内源性非编码调控的单链小RNA分子,长度约22个核苷酸。miRNAs介导的基因调控发生在转录后水平,通过与其靶mRNA分子的3’非翻译区(3’un-translated region,3’UTR)互补配对,使靶mRNA分子的翻译受到抑制或直接降解靶mRNA,从而对靶基因的表达起负性调控作用。研究发现,miRNAs不仅参与了个体的生长、发育、凋亡、分化等多种生理过程,在机体多种病理过程中也发挥着重要作用,包括肿瘤的发生和发展。最近多项研究证实,miRNAs在RCC的发生发展中具有重要作用,可通过直接靶向作用一些癌基因或抑癌基因而调控RCC细胞的生长、凋亡和侵袭转移等生物学行为。尽管miRNAs在RCC发生发展调控中的重要性业已吸引了国内外众多学者的关注,绝大多数miRNAs在RCC中的作用及其作用机制依然未知,迫切需要进一步研究。为了探索miR-205与肾透明细胞癌发生、发展的关系,我们在本研究首先利用实时定量PCR检测了肾透明细胞癌组织及癌旁非肿瘤组织中miR-205的表达情况,并研究其与肾癌临床分期、病理分级之间的关系。然后检测了miR-205在各肾癌细胞株及正常肾小管上皮细胞株中的表达情况,并以此筛选出合适的肾癌细胞株作为体外研究对象,研究miR-205对肾癌细胞生长、凋亡、侵袭迁移等生物学行为的影响。最后用生物信息学预测miR-205可能的靶基因,并用体外实验进行初步验证,探讨miR-205在肾透明细胞癌中可能的作用机制,为肾癌的诊断和治疗提供新的思路。[方法与结果]1.miR-205在肾透明细胞癌组织中的表达水平显著下调：采用实时定量PCR检测20例ccRCC组织及癌旁非肿瘤组织中miR-205的相对表达量,结果miR-205在ccRCC组织组织中的表达显著低于癌旁非肿瘤组织(3.60±1.92vs6.39±3.39,P<0.05)。2.miR-205的低表达与肾癌临床分期、病理分级无相关：根据病理分级和临床分期分别将20例ccRCC组织样本进行分组并比较各组之间miR-205的表达,结果发现高分化组(n=12)与中-低分化组(n=8)、Ⅰ期(n=13)与Ⅱ-Ⅲ期(n=7)之间miR-205的相对表达量均无显著差异(分别为3.66±2.24vs3.51±1.42和3.73±2.16vs3.36±1.48,P>0.05)。3.过表达miR-205抑制ACHN细胞的生长和侵袭转移、诱导凋亡：利用实时定量PCR检测肾癌细胞株Caki-1、ACHN及正常肾小管上皮细胞HK-2中mir-205的表达,结果显示,miR-205在Caki-1、ACHN细胞中的相对表达量均显著低于HK-2细胞(分别为1.32±0.13、1.06±0.13、3.95±0.37,P<0.05),且在ACHN细胞中的表达水平最低。选取ACHN作为研究对象,使用LipofectamineTM2000转染miR-205mimics于ACHN株,升高miR-205的表达。实验分组：空白对照组(B.C)、miR-205阴性对照组(N.C)、miR-205模拟物转染组(miR-205),实时定量PCR检测各组miR-205的表达水平,MTT法、Annexin V&PI双染法、流式细胞术(FCM)、Transwell细胞侵袭实验和迁移实验分别观察各组ACHN细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭能力的变化,结果显示,miR-205组中miR-205的相对表达含量显著高于B.C组、N.C组(依次为3.95±1.15、1.35±0.51、1.37±0.41,P<0.05)；MTT结果显示与B.C组、N.C组相比,miR-205组ACHN细胞生长出现明显抑制(P<0.05)；凋亡实验结果显示miR-205组ACHN细胞的凋亡率明显高于B.C组、N.C组(依次为12.37±1.38%、3.53±0.61%、3.72±0.66%,P<0.05)；流式细胞周期分析显示与B.C组、N.C组相比,miR-205组处于亚G1期中的细胞数明显升高,而相应S期中细胞数目却出现明显减少(P<0.05); Transwell侵袭和迁移实验结果显示,miR-205组细胞侵袭和迁移能力较B.C组、N.C组明显下降(P<0.05)。4.miR-205可能直接靶向调控E2F1和ZEB2：利用miRbase、 TargetScan、miRanda等生物信息学方法预测miR-205可能的靶基因E2F1、ZEB2,实时定量PCR和Western blot分别检测ACHN、Caki-1、HK2细胞中E2F1和ZEB2的表达及过表达miR-205对ACHN细胞中E2F1和ZEB2表达的影响,结果显示,ACHN、Caki-1细胞中E2F1和ZEB2在mRNA和蛋白表达水平均显著高于HK2(P<0.05)。 mfR-205组中ZEB2在mRNA和蛋白表达水平均显著低于B.C组、N.C组(P<0.05),miR-205组中E2F1蛋白表达水平显著低于B.C组、N.C组(P<0.05),但E2F1mRNA在三组中的表达无明显差异(P>0.05)5.miR-205可能通过E2F1调控AKT信号通路：利用Western blot分别检测B.C组、N.C组、miR-205组中AKT、pAKT、BAD、pBAD蛋白的表达,结果显示,miR-205组中pAKT和pBAD蛋白表达含量显著低于B.C组、N.C组(P<0.05),而AKT和BAD蛋白表达含量在三组中无明显差异P>0.05)。6.miR-205可能通过ZEB2调控EMT:采用免疫组化法检测20例ccRCC及癌旁非肿瘤组织中E-cadherin和Vimentin的表达,实时定量PCR法和Western blot法检测ACHN、Caki-1、HK2由E-cadherin、 Vimentin的表达及过表达miR-205对ACHN细胞中E-cadherin、 Vimentin表达的影响,结果显示,ccRCC组织中E-cadherin阳性率明显低于癌旁非肿瘤组织(35%vs75%, P＜0.05), ccRCC组织中Vimentin阳性率明显高于癌旁非肿瘤组织(80%vs25%, P<0.05)。ACHN.Caki-1细胞中E-cadherin在mRNA和蛋白表达水平均显著低于HK2(P<0.05), ACHN、Caki-1细胞中Vimentin在mRNA和蛋白表达水平均显著高于HK2(P<0.05)。miR-205组中E-cadherin在mRNA和蛋白表达水平均显著高于B.C组、N.C组(P<0.05), miR-205组中Vimentin在mRNA和蛋白表达水平均显著低于B.C组、N.C组(P<0.05)。[结论]1.在ccRCC组织中miR-205的表达显著下调,提示miR-205可能与ccRCC的发生发展密切相关。miR-205表达水平的检测可能有助于肾透明细胞癌的诊断。miR-205表达水平与ccRCC的临床分期及病理分级无显著相关。2.miR-205在人肾癌细胞株ACHN、Caki-1中的表达显著低于人正常肾小管上皮细胞株HK-2中的表达。has-miR-205mimics能有效转染人肾癌细胞株ACHN,并升高ACHN细胞中miR-205的表达。3.过表达miR-205能够有效抑制ACHN细胞的增殖及侵袭迁移能力,促进ACHN细胞的凋亡,提示miR-205在肾癌中发挥抑癌基因的作用,上调miR-205表达可能是一种治疗肾癌的有效手段。4.肾癌细胞ACHN中miR-205可能直接靶向调控E2F1和ZEB2的表达。过表达miR-205诱导ACHN细胞凋亡的机制可能是抑制E2F1介导的AKT信号通路的活性。5.肾透明细胞癌中可能存在EMT机制,过表达miR-205抑制ACHN细胞侵袭迁移的机制可能是抑制ZEB2介导的EMT的发生。