【摘 要】
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多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一种重要的人畜共患致病菌,不同血清型的Pm可引起猪肺疫、禽霍乱等多种疾病,给世界各国的养殖业造成巨大的经济损失。天然的多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida toxin,PMT）是由tox A基因（3858 bp）编码的分子量为146 k Da的蛋白,具有极强的毒性,免疫原性弱。本研究旨在聚焦PMT多表位重
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多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一种重要的人畜共患致病菌,不同血清型的Pm可引起猪肺疫、禽霍乱等多种疾病,给世界各国的养殖业造成巨大的经济损失。天然的多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida toxin,PMT）是由tox A基因（3858 bp）编码的分子量为146 k Da的蛋白,具有极强的毒性,免疫原性弱。本研究旨在聚焦PMT多表位重组抗原（rPMT）的构建与可溶性表达,探究rPMT对Pm的免疫保护作用,为Pm亚单位疫苗研发提供新思路和理论参考。一是构建并合成了多表位重组抗原基因rpmt（1974 bp）。运用DNA Star 7.1、免疫表位数据库（IEDB）等生物信息学软件对PMT的二级结构、抗原性、B细胞表位、T细胞表位等进行分析,依据综合得分筛选出18个B细胞和13个T细胞的优势表位,构建了70 k Da的多表位重组抗原（rPMT）,而后将rPMT的氨基酸翻译为核苷酸序列并进行密码子优化,得到了rpmt基因（1974 bp）,加入酶切位点后合成、连接至p ET-32a（+）质粒。二是成功表达了含GST标签的可溶性抗原rPMT（97 k Da）。以p ET-32a（+）-rpmt质粒为模板,将rpmt基因克隆至pGEX-4T-1质粒（含GST标签）,后转入大肠杆菌感受态BL21（DE3）,在18℃、180 r/min的条件下诱导表达24 h,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,成功表达出97 k Da的可溶性抗原rPMT。三是证实了rPMT在小鼠模型上对Pm具有一定的免疫保护作用。将rPMT与佐剂MONTANIDETM Gel 02 ST按比例（10:1）混合,对小鼠进行三次免疫,后测定IgG抗体效价、脾淋巴细胞增殖率、血清中细胞因子含量和攻毒保护率等指标。结果表明:小鼠血清中IgG抗体效价显著增高,抗体水平呈现逐渐增长的规律,说明体液免疫反应被显著激活;脾淋巴细胞显著增殖,增殖率为39.42%,说明细胞细胞应答被激活;小鼠血清中细胞因子IL-12和IFN-γ均显著上调,但IL-4无显著变化,初步表明rPMT能引起Th1型的免疫反应,即增强细胞免疫反应;攻毒试验中rPMT能为感染Pm的小鼠提供57%（8/14）的免疫保护力,说明rPMT对Pm具有一定的免疫保护作用;肺脏组织病理学和免疫组织化学分析说明,rPMT能明显减轻小鼠肺脏病变程度和中性粒细胞浸润程度。
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