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[目的]
衰老研究是医学及发育生物学的重要分支,酿酒酵母是研究寿命和衰老的良好模式生物。酿酒酵母铁硫蛋白Nar1p参与电子传递链和氧化应激反应,本研究室前期研究表明Nar1p的编码基因NAR1缺失酵母细胞的复制寿命明显缩短,并能被SOD过表达所拯救。本文拟进一步探讨NAR1缺失和SOD过表达后酵母细胞抗氧化损伤能力的变化,通过检测NAR1相关基因(NBP35、KSP1、DRE2、YHR122W、 CIA1和RL11)缺失酵母的寿命,以期揭示NAR1基因在抗氧化损伤中的作用及影响酵母衰老的可能通路。
[方法]
1.在标准的AXIO光学显微镜下,用纤维针对酵母出芽的子细胞进行分离并计数,统计酵母菌株的复制型寿命。
2.实时定量荧光PCR仪检测酵母细胞SOD转录水平的差异。
3.玻璃珠法裂解酵母细胞,提取活性酵母衍生物,利用总SOD活性检测试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒,分别检测活性酵母衍生物中总SOD活性和蛋白含量。
4.使用荧光探针DCFH-DA检测酵母细胞的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。
5.克隆形成实验观察酵母细胞抗氧化能力的变化情况。
6.使用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)检测酵母细胞线粒体氧化损伤的情况。
7.酶标仪检测酵母细胞顺乌头酸酶的含量。
8.利用同源重组的方法将破坏元件转化到酵母菌株,构建NAR1相关基因缺失酵母菌株。
[结果]
1.敲除NAR1,酵母细胞的克隆形成能力减弱、SOD2转录水平降低、ROS水平升高、顺乌头酸酶比活性降低、线粒体DNA损伤比例升高,酵母细胞的复制型寿命从野生型的33.68代,缩短为27.51代。
2.NAR1缺失酵母细胞中过表达SOD1,细胞中SOD活性升高、线粒体DNA损伤比例没有明显变化、寿命为29.92代。
3.NAR1缺失酵母细胞中过表达SOD2,细胞中SOD活性未检测到明显变化,线粒体DNA损伤比例降低、寿命为30.33代。
4.NAR1缺失酵母细胞中双过表达SOD1和SOD2,总SOD活性升高,克隆形成能力增强,线粒体DNA损伤比例降低、寿命为31.61代。
5.成功构建与NAR1相关基因(NBP35、KSP1、DRE2、YHR122W、CIA1和RLI1)的缺失酵母菌株,结果表明,敲除NAR1相关基因(KSP1、DRE2、YHR122W和CIA1),其复制型寿命是缩短的。
[结论]
NAR1缺失导致酵母细胞氧化应激敏感性增加,抗氧化损伤能力减弱,ROS水平升高,线粒体DNA损伤增加,从而导致细胞寿命缩短。SOD能提高NAR1缺失酵母的抗氧化能力,在一定程度上拯救NAR1缺失导致的酵母复制型寿命缩短。NAR1相关基因KSP1、DRE2、YHR122W和CIA1敲除的酵母细胞复制型寿命均明显缩短,表明NAR1可能通过影响铁硫蛋白的生成,来影响酵母寿命。