目的缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)损伤是指各种原因造成的局部组织器官的缺血缺氧,使组织细胞发生缺血性损伤(ischemia injury),在一定条件下恢复血液再灌注后,细胞功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反而加重的现象。缺血再灌注期间发生复杂的病理、生理变化,缺血再灌注可挽救濒临死亡的细胞,也可加重细胞损伤,导致细胞死亡。缺血性脑血管病已经成为当今世界致死、致残的最主要疾病之一,因此,如何减少脑缺血再灌注损伤是治疗脑缺血性疾病过程中急需解决的关键问题。近来研究发现,脑缺血再灌注使脑的细胞产生损伤是一个快速的级联反应,这个级联反应包括许多环节,炎性反应是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。越来越多的报道显示:即使没有感染存在,受损及应激状态细胞发出的信号也可以引发免疫反应。TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一种模式识别受体(patternrecognition receptor,PRRs),能识别病原体,在病原体入侵机体的早期启动固有免疫,TLR4介导的髓样分化蛋白MyD88(myeloid differentiation protein 88,MyD88)信号转导通路在抗感染中发挥重要作用。目前,对TLR4介导的MyD88信号转导通路的研究主要集中在抗感染免疫反应中。脑缺血再灌注损伤中炎性反应发挥了重要作用,但TLR4介导的MyD88信号转导通路在脑缺血再灌注损伤中是否被激活而发挥作用尚未见相关报道。在抵抗病原体入侵的免疫应答启动过程中TLR4介导的MyD88信号转导通路能调节多种炎症相关基因的表达。TLR4被激活后引起自身的二聚化与MyD88结合,MyD88通过其死域(death domain,DD)与白细胞介素-1受体相关激酶(IL-1receptor-associated kinase,IRAK)结合,导致IRAK的自身磷酸化,从而激活肿瘤坏死因子受体相关因-6(tumor necrosis factorreceptor-associated factor 6,TRAF6),使有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated p rotein kinase,MAPK)家族活化,其中核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)诱导激酶激活I-κB家族α、β激酶,导致I-κB磷酸化而降解,使NF-κB移位到细胞核,启动TNF-α、IL-1、IL-6等炎性细胞因子的转录。本研究旨在观察小鼠海马CA1区和顶叶皮质在脑缺血再灌注过程中TLR4介导的MyD88信号转导通路是否被激活;采用TLR4抗体封闭阻断TLR4受体后,TLR4介导的MyDS8信号转导通路中相关信号分子、脑组织炎性反应及神经元损伤的变化情况,探讨脑缺血再灌注损伤过程中的分子机制,为临床减轻脑缺血再灌注损伤提供新的研究和治疗方向。实验方法1、实验动物的分组健康昆明种小鼠144只,雌雄兼用,体重18～22克,由中国医科大学实验动物中心提供,随机分为3组:(1)假手术组(S组,n=48);(2)缺血再灌注组(I组,n=48);(3)TLR4阻断组(T组,n=48)。各组又分12h、24h、48h、72h 4个时间点。2、小鼠脑缺血再灌注模型的制备采用阻断小鼠两侧颈总动脉(common carotid arteries,CCA)血流后再实现再灌注的方法。在阻断双侧颈总动脉血流后,出现心跳加快、呼吸幅度加深、频率先加快、后减慢典型生理变化过程的小鼠,作为缺血成功样本入选。TLR4阻断组小鼠在右侧颈总动脉内注入TLR4抗体(10μg/ml),缺血再灌注组注射等量生理盐水,假手术组只分离双侧颈总动脉。3、组织切片的制备以上各组动物分别于再灌注不同时间点,用多聚甲醛灌注固定,取脑,常规石蜡包埋,用切片机作连续脑冠状切片(片厚7μm)。4、HE染色观察海马、皮质组织病理学变化、图像分析与统计学处理5、海马CA1区、顶叶皮质神经元神经病理损伤评分与统计学处理6、Western blot检测海马、皮质TLR4、MyD88、TNF-α、IL-1β表达、图像分析及数据处理7、采用TLR4、MyD88原位杂交检测试剂盒检测切片TLR4mRNA、MyD88mRNA表达、图像分析与统计学处理8、凝胶电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)检测NF-κB结合活性与统计学处理9、免疫组织化学染色检测TNF-α、IL-1β表达、图像分析与统计学处理实验结果1、组织病理学观察结果HE染色可见假手术组右侧海马CA1区和顶叶皮质细胞形态正常,细胞排列整齐、形态完整;缺血再灌注组细胞排列散乱,有的胞浆有空泡形成,有的神经元肿胀、分布不均、核固缩深染、核仁消失;TLR4阻断组神经元胞体肿胀明显减轻,细胞形态明显改善。2、神经病理损伤评分结果假手术组右侧海马CA1区、顶叶皮质神经元在各再灌注时间点神经病理损伤评分均较低;TLR4阻断组和缺血再灌注组的神经病理损伤评分均有不同程度的增高,两组与假手术组比较差异有显著性(P<0.05)。TLR4阻断组在各再灌注时间点神经病理损伤评分均低于缺血再灌注组(P<0.05)。3、Western blot检测TLR4、MyD88表达及分析结果在小鼠右侧海马CA1区和顶叶皮质,缺血再灌注组TLR4蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组表达水平。缺血再灌注组TLR4表达条带的IDV值(integrated density value)高于TLR4阻断组IDV值(P<0.05)。缺血再灌注组MyD88蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组表达水平。缺血再灌注组MyD88表达条带的IDV值高于TLR4阻断组IDV值(P<0.05)。4、TLR4mRNA、MyD88mRNA原位杂交染色及分析结果在小鼠右侧海马CA1区和顶叶皮质,缺血再灌注组和TLR4阻断组有明显的TLR4mRNA表达。TLR4阻断组TLR4mRNA阳性反应产物的平均光密度值低于缺血再灌注组(P<0.05),缺血再灌注组TLR4mRNA阳性反应产物平均光密度值高于假手术组(P<0.05)。在小鼠右侧海马CA1区和顶叶皮质,缺血再灌注组和TLR4阻断组有明显的MyD88mRNA表达。TLR4阻断组MyD88mRNA阳性反应产物的平均光密度值低于缺血再灌注组(P<0.05),缺血再灌注组MyD88mRNA阳性反应产物平均光密度值高于假手术组(P<0.05)。5、NF-κB结合活性及分析结果缺血再灌注组小鼠右侧海马CA1区和顶叶皮质NF-κB结合活性明显高于TLR4阻断组和假手术组水平(P<0.05)。缺血再灌注组NF-κB条带的IDV值高于TLR4阻断组IDV值(P<0.05)。6、Western blot检测TNF-α、IL-1β表达及分析结果采用Western blot方法检测各组小鼠右侧海马CA1区IL-1β表达水平和顶叶皮质TNF-α表达水平。Western blot分析显示缺血再灌注组IL-1β蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组表达水平。缺血再灌注组IL-1β表达条带的IDV值高于TLR4阻断组IDV值(P<0.05)。各组小鼠右侧顶叶皮质TNF-α蛋白表达水平分析显示缺血再灌注组TNF-α蛋白表达水平明显高于TLR4阻断组和假手术组表达水平。缺血再灌注组TNF-α表达条带的IDV值高于TLR4阻断组IDV值(P<0.05)。7、TNF-α、IL-1β免疫组化染色及分析结果采用免疫组化方法检测各组小鼠在各灌注时间点右侧海马CA1区IL-1β的表达的结果是:假手术组海马CA1区IL-1β表达很少,TLR4阻断组IL-1β免疫染色加深,缺血再灌注组IL-1β表达比TLR4阻断组增多。缺血再灌注组IL-1β阳性产物的平均光密度值大于TLR4阻断组和假手术组。缺血再灌注组IL-1β阳性表达产物的平均光密度值高于TLR4阻断组平均光密度值(P<0.05)。各组小鼠在各灌注时间点右侧顶叶皮质TNF-α表达结果是:假手术组顶叶皮质TNF-α表达很少,TLR4阻断组TNF-α免疫染色加深,缺血再灌注组TNF-α表达比TLR4阻断组增多。缺血再灌注组TNF-α阳性产物的平均光密度值大于TLR4阻断组和假手术组。缺血再灌注组TNF-α阳性表达产物的平均光密度值高于TLR4阻断组平均光密度值(P<0.05)。结论1、脑缺血再灌注可激活TLR4,在海马CA1区和顶叶皮质均出现TLR4过表达,TLR4参与脑缺血再灌注损伤的反应机制。2、TLR4阻断后可减轻脑组织海马CA1区和顶叶皮质缺血再灌注神经元损伤,提示TLR4参与脑缺血再灌注损伤的炎症反应机制。3、在脑缺血再灌注TLR4激活后,引起其胞内衔接蛋白MyD88表达量增加,而采用TLR4抗体阻断后,MyD88表达量减少。提示TLR4通过上调MyD88表达参与脑缺血再灌注损伤的炎症反应机制。4、在脑缺血再灌注中NF-κB被激活,并引起炎症因子IL-1β和TNF-α的过表达,TLR4阻断后,NF-κB结合活性明显降低,炎症因子IL-1β和TNF-α的表达也减少;说明TLR4通过上调NF-κB,IL-1β和TNF-α表达参与脑缺血再灌注损伤的炎症反应机制。5、在脑缺血再灌注中TLR4介导的MyD88信号转导通路被激活,TLR4阻断后,可减轻脑缺血再灌注损伤中的炎症反应,说明TLR4-MyD88信号转导通路参与脑缺血再灌注损伤的炎症反应机制。