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背景梓醇是中药地黄的主要有效成分之一,既往研究表明,梓醇在脑缺血急性期给药具有神经保护作用,能够改善脑缺血大鼠神经行为学功能,促进缺血区周围血管新生和成体神经干细胞增殖存活,但梓醇延迟给药对于脑缺血大鼠的效应以及对神经干细胞的分化作用暂未研究。基于治疗脑缺血疾病药物匮乏的现状,且目前唯一公认有效的静脉溶栓药物组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t PA)的治疗时间窗狭窄(3-4.5 h),该时段内极大多数患者不能及时就医。梓醇作为缺血性脑损伤的潜在保护剂,如果在t PA治疗时间窗外能够保护缺血脑区及周围组织,研究其药效学作用及对新生神经干细胞的分化作用,具有重要的科学价值和临床意义。本课题受国家自然科学基金项目(81873034)资助。目的观察梓醇延迟给药对局灶性永久性脑缺血大鼠的神经行为学影响以及神经新生效应和神经干细胞分化作用研究。方法1.SD大鼠随机分为6组,分为假手术组,模型组,造模后6 h首次给药组(5 mg/kg和10 mg/kg),造模后4 d首次给药组(5 mg/kg和10 mg/kg),电凝法制备局灶性永久性脑缺血(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)模型,给药组腹腔注射梓醇,对照组注射同等剂量生理盐水,每日一次,连续7天。各组大鼠分别于给药后1,4,7,14,21,28天进行体重测量及Bederson评分,神经功能缺损评分(modified neurologic severity score,m NSS),肌力测试评分(muscle strength),对神经功能恢复进行评价。2.结合Brd U体内标记细胞增殖,梓醇给药7,14,21,28天后各组大鼠取材,免疫荧光双标Brd U/Nestin检测室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞增殖存活情况,Brd U/GFAP,Brd U/DCX和Brd U/Neu N荧光双标检测神经干细胞分化为星形胶质细胞及神经元情况;免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组损伤侧SVZ区Nestin/DCX以及损伤侧皮层GFAP和Neu N的蛋白表达。3.由于新生鼠SVZ数量少且难以分离,本研究选择原代培养24 h内新生鼠海马区神经干细胞,进行纯化鉴定,Brd U标记细胞增殖,cck-8检测不同浓度的梓醇对神经干细胞活力的影响,加入分化培养基诱导干细胞分化,免疫荧光MAP-2,GFAP,MBP检测细胞分化,WB检测分化表型相关蛋白的表达。结果1.成功制备局灶性脑缺血模型,梗死体积为9.62±2.43%。行为学实验结果表明,梓醇给药组不同程度促进脑缺血大鼠体重增长,降低脑缺血大鼠Bederson和神经功能缺损评分,提高肌力测试评分,6h,5mg/kg组肌力测评分在14天时有显著差异(P<0.05,vs model),21天时各组神经功能基本恢复至假手术水平,各给药组间无显著差异(P>0.05,vs sham)。2.梓醇给药后不同时点促进局灶永久性脑缺血大鼠损伤侧SVZ区神经干细胞增殖存活,Brd U/Nestin荧光结果提示脑区成体神经干细胞存在的事实。脑缺血后7天及14天,星形胶质细胞数量显著增加(P<0.05,vs model),新生神经干细胞与神经元数量与模型组相比显著增加(P<0.05,vs model),14天时DCX表达增强,6 h,5 mg/kg剂量组与模型组相比有显著差异(P<0.05,vs model),其余给药组与假手术相比有显著差异(P<0.05,vs sham),21天时各给药组GFAP表达降低,Nestin,Neu N表达增强,与模型组相比有显著差异(P<0.05,vs model),与行为学结果基本一致。3.海马神经干细胞培养7 d后可增殖为直径为200μm左右的神经球,神经球呈现Brd U/Nestin免疫双标阳性;cck-8筛选出促进神经干细胞生长的梓醇浓度为0.1,1,10,100μM;用不同浓度的梓醇诱导P3代神经干细胞分化7天,可见MAP-2阳性的神经元,GFAP阳性的星形胶质细胞及MBP阳性表达的少突胶质细胞;10μM梓醇促进NSCs向神经元方向分化,0.1μM促进向星型胶质细胞方向分化。结论1.梓醇延迟给药促进局灶性永久性脑缺血大鼠体重增长,改善神经行为学评分。2.梓醇延迟给药促进局灶性永久性脑缺血大鼠损伤侧SVZ区神经干细胞增殖,促进缺血区域附近神经元存活,减少星形胶质细胞增殖。3.原代培养的海马神经干细胞具有旺盛的自我增殖和多向分化潜能,梓醇对神经干细胞向神经元和胶质细胞分化的作用有剂量效应。