目的：黑色素瘤是恶性程度最高的恶性肿瘤之一，晚期黑色素瘤患者总生存期低，预后差。做为预后最差的皮肤恶性肿瘤，近年来，其在世界范围内的其发病率和死亡率均持续上升。众所周知，在原发灶切除后，黑色素瘤有很高的复发、转移风险。且转移性黑色素瘤对高剂量IFN-α2b、化疗、放疗、免疫治疗以及新近发展起来的分子靶向治疗等治疗手段均表现出高抵抗性。对于那些没有BRAF突变以及BRAF突变患者经BRAF抑制剂治疗后进展的患者，几乎没有特别有效的治疗手段可以选择。因此，深入研究黑色素瘤的转移机制和寻找一种可能的治疗手段显得十分必要。目前，大量的研究结果支持钙蛋白酶在肿瘤细胞的增殖、迁移、转移中起作用。钙蛋白酶是一类细胞内钙依赖性半胱氨酸蛋白酶家族，它包括无处不在的μ-钙蛋白和m-蛋白。μ-钙蛋白和 m-钙蛋白均形成异二聚体，二聚体分别包括被钙蛋白酶1（Capn1）基因和钙蛋白酶2基因（ Capn2）编码的80 kDa的催化亚单位和被Capn4基因（CAPNS1，钙蛋白酶小亚基1）编码的28 kDa调节亚单位。在过去的几十年中，大量研究发现钙蛋白酶的活性与多种生理过程及病理过程有关。这些生理过程包括细胞支架的重建、细胞信号、凋亡和细胞生存；病理过程包括肿瘤细胞的粘附、迁移和侵袭等过程。μ-钙蛋白和m-钙蛋白在骨肉瘤、横纹肌肉瘤、肝细胞癌、结直肠癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常活化。作为钙蛋白酶亚单位之一的Capn4，其功能也包括了调节肿瘤细胞凋亡、迁移和侵袭等等。目前研究发现，Capn4与多种肿瘤的迁移、侵袭有关，如：下调Capn4抑制了脑胶质瘤细胞的侵袭、迁移，降低了金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白（vimentin）和N-钙蛋白（N-cadherin）的水平。Capn4的过表达与肝癌、肝内胆管癌（ICC）、肾透明细胞癌(ccRCC)、鼻咽癌(NPC)、非小细胞肺癌（NSCLC）的侵袭和转移有关。Capn4被认为可能作为HCC、ICC、NPC的一种分子靶向治疗手段。研究证实，多种通路在恶性肿瘤细胞的迁移和侵袭中起调节作用，这些通路包括Wnt/β-catenin（β-catenin）信号通路、EMT和NF-κB(p65)通路等。广泛存在的β-catenin信号通路被称为促进肿瘤进程的“致瘤”信号通路，它影响恶性肿瘤细胞粘附、生长和分化等细胞进程。研究发现，β-catenin在多种肿瘤细胞中核内是增高的。异常的Wnt/β-catenin信号通路被发现在黑色素瘤的发生中起重要作用。EMT是恶性肿瘤转移过程中最重要的事件之一，EMT通过改变肿瘤周围的微环境以利于肿瘤细胞从原发部位向远处转移。研究发现，钙蛋白酶在EMT中亦发挥作用。在EMT过程中，E-钙蛋白（E-cadherin）被下调，N-钙蛋白（N-cadherin）和vimentin被上调。NF-κB在不同肿瘤模型中表现出促进肿瘤进展的功能。它在黑色素瘤细胞中也表现出高活性。有研究报道，在黑色素瘤肿瘤的发生进程中，NF-κB起调节作用。大量的研究证实，β-catenin信号通路、EMT通路和NF-κB（P65）信号通路之间存在“相互对话”，并且互相影响活性及功能。如：体内外试验发现，在肺腺癌细胞中抑制β-catenin信号通路的活性，可以抑制癌细胞的生长和EMT进程。在结肠癌细胞和乳腺癌细胞中，β-catenin信号通路和NF-κB通路相互影响。体内外试验发现，敲除Capn4抑制细胞迁移、侵袭。下调Capn4抑制脑胶质瘤细胞的迁移、侵袭，且降低了vimentin和 N-cadherin的表达水平。通过分析GEO：GSE3189基因芯片，发现Capn4在黑色素瘤组织中高表达。目前Capn4在黑色素瘤中的作用机制尚不明确，本研究以β-catenin及EMT为靶向切入点，研究Capn4在恶性黑色素瘤细胞中的作用及机制，旨在发掘黑色素瘤细胞可能的迁移及侵袭机制、提供一种新的恶性黑色素瘤的分子靶向治疗奠定实验及理论基础。　　方法：⑴从重庆医科大学附属第一医院收集黑色素瘤组织120例，正常组织34例供免疫组化用。把黑色素瘤组织及正常组织用多聚甲醛固定，然后经过不同浓度的酒精梯度脱水，再用二甲苯透明，然后用石蜡包埋。然后让其自然冷却、凝固，然后切片。经甲醛固定、脱水、烤片等处理。为了封闭抗原中的部分非特异性位点，我们在组织切片上滴加山羊血清工作液，再在每张切片上加1滴第一抗体（一抗 Capn4）。经相关处理后在每张组织切片上加1滴酶标抗兔的第二抗体（辣根过氧化物酶标记），在室温下孵育30min。经孵育、洗涤后在组织切片上滴加 DAB工作液。在光学显微镜下观察组织切片的显色情况，当观察到淡黄色时，就判断为阳性表达，随即终止显色。再经冲洗、苏木素染核、酒精梯度脱水等处理。本部分实验均由两名病理科医师独立阅片以及记录结果。组织切片中细胞核或细胞浆出现（棕）黄色颗粒即为Capn4目的蛋白的阳性表达。⑵将人黑色素瘤细胞株A375、SK-MEL-1、MV3、M14以及HaCaT细胞培养于相应的培养基中。待细胞生长到融合度约达80％时，用胰酶消化传代，传代后的细胞继续培养。用细胞刮刮下贴壁生长的细胞并将细胞转移到EP管中，弃去上清液，加入细胞裂解液。采用 BCA蛋白浓度测定试剂盒来检测所提取的蛋白样品浓度，以细胞蛋白抽提裂解液为空白对照。吸光度值测定波长调整为562nm，依次测定各样品的吸光度值，每份细胞标本均测定3个测定值，取这三个反应值的均值作为结果。聚丙稀酰胺凝胶电泳，以目的蛋白的大小为依据，切下所需的胶条。经过转膜、封闭等处理，将已稀释好的Capn4一抗均匀滴于蜡板上，过夜后再加入二抗（辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液（S-A/HRP））孵育。再滴加适量ECL显影液于蜡板上。放入凝胶成像仪中显影。内参蛋白的灰度值及目的蛋白的灰度值均通过Quantity one软件计算后得到。目的蛋白的相对表达量为：目的蛋白（Capn4）与内参蛋白（GAPDH）灰度值之比。⑶根据目的基因Capn4设计3个靶点（shRNA1、shRNA2、shRNA3）做为实验组以及1个无干扰功能的靶点为做对照组（Control shRNA）。把单链的引物退火成双链oligo序列（寡聚T核苷序列），连接入双酶切线性化的RNA干扰载体。测序验证正确的转化子，进行高纯度质粒抽提。将黑色素瘤细胞株A375培养于DMEM+10%FBS的培养基中，当细胞生长至融合度达80%左右时，加入胰酶消化传代，传代后的细胞继续培养，为后续实验做准备。将黑色素瘤细胞株A375分成四组实验：1组为对照组（con，Control shRNA），3组为实验组（shRNA1、shRNA2、shRNA3）。将构建的Capn4干扰载体分别转染到细胞株中，转染成功后提取蛋白，“蛋白提取、电泳及灰度分析”步骤同“1.2 WB检测黑色素瘤细胞及HaCaT细胞中Capn4的表达”中的步骤。取每份细胞株3次试验的平均值做统计学分析。⑷实验将A375/M14两种细胞分别分成两组：对照组 con(Control shRNA)及实验组shRNA（shRNA1）。将A375细胞株及M14细胞株培养于相应的培养基中。取1.5×105个处于对数生长期的A375/M14细胞接种于六孔板内，当融合率达到60%左右时进行转染。将DNA-Lipofectamine2000复合物添加到细胞中、转染。用WB法检测转染成功细胞的Capn4的表达。“一抗、二抗、蛋白提取、电泳及灰度分析”步骤同“1.2 WB检测黑色素瘤细胞及HaCaT细胞中Capn4的表达”中的步骤。取每份细胞株3次试验的平均值做统计学分析。⑸分别将A375细胞株、M14细胞株培养于相应的培养基中。将前期构建的Capn4干扰载体转染到A375和M14细胞株中。含有干扰Capn4功能的 shRNA载体为 shRNA实验组，含有无干扰功能的 Control shRNA载体为con对照组，共4组细胞。转染方法同“2.2细胞转染”。在96孔板的每孔铺90μl含细胞的细胞悬液，即每孔含2.0×103 cells。每孔中各加10μl的5mg/ml的MTT液孵育，在第1d、2d、3d、4d、5d的时间点连续检测。在酶联免疫监测仪上选择450nm波长测定各孔光吸收值，即450nm波长测OD值（optical density，光密度），并记录结果。取每份细胞标本3次试验的平均值进行统计学分析。SPSS软件根据平均值画出A375及M13细胞的生长曲线（以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线）。⑹细胞培养及转染方法同前。将前期构建的Capn4干扰载体转染到A375和M14细胞株中。含有干扰Capn4功能的shRNA载体为shRNA实验组，含有无干扰功能的Control shRNA载体为con对照组。分别将A375/M14实验组及对照组细胞配成1×106个细胞/ml的细胞悬液；在铺有载玻片的24孔板中按每孔2×104个细胞进行接种，在孵箱中培养12h后用4%多聚甲醛固定等处理，再将TUNEL染色液加入每孔中，避光条件下孵育1h。孵育结束的细胞一部分直接用于TUNEL荧光分析、一部分用于DAPI实验。将用于DAPI实验的细胞用PBS浸洗3次后加入DAPI染色液进行细胞核染色，染色10 min后洗涤。将TUNEL染色及DAPI染色的细胞分别用抗荧光淬灭封片液封片，染后在荧光显微镜下观察，计数TUNEL阳性细胞，观察DAPI染色细胞的形态。⑺细胞培养及转染方法同前。将前期构建的Capn4干扰载体转染到A375和M14细胞株中。含有干扰Capn4功能的shRNA载体为shRNA实验组，含有无干扰功能的Control shRNA载体为con对照组。一抗为cleaved-caspase3，其余实验步骤，如：蛋白的提取、电泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相对表达量为：目的蛋白（Claeved-Caspase-3）与内参蛋白（GAPDH）灰度值之比。取每种细胞株3次试验的平均值做统计学分析。⑻迁移实验：分别将A375细胞株、M14细胞株培养于相应的培养基中。将前期构建的Capn4干扰载体转染到 A375和M14细胞株中（shRNA实验组），含有无干扰功能Control shRNA载体的细胞为（con）对照组。取3×105 cells加入到Transwell小室中，置于37℃，5%CO2条件下培养。培养48h-96h后将上室内的培养基去掉，用棉棒将上室内的细胞去掉，用结晶紫染色液进行染色。染色后用显微镜拍照、计数。侵袭实验：在“迁移实验”步骤的“将细胞加入Transwell小室”前，加做步骤：“用1：8稀释的Matrigel液包被Transwell小室底部膜的上室面，使其聚合成凝胶”，其余步骤与“迁移实验”相同。⑼A375细胞培养及Capn4干扰（shRNA转染）方法同前。将出生满五周的BALB/c雄裸鼠随机分成2组（实验组：shRNA组；对照组：con组），每组3只。每只BALB/c裸鼠左侧腹部皮下注射5×106个细胞。从第十天开始检测各组肿瘤体积，麻醉后游标卡尺测肿瘤体积，肿瘤体积（单位：mm3）=长×宽×宽/2。每周记录一次。观察肿瘤体积。第四周后以颈椎脱臼致死法处死裸鼠取得肿瘤组织。⑽分别将A375细胞株、M14细胞株培养于相应的培养基中。将前期构建的Capn4干扰载体转染到A375和M14细胞株中（shRNA转染）实验组，含有无干扰功能Control shRNA载体的细胞为（con）对照组。一抗为Capn4、β-catenin-T（总蛋白）、β-catenin-N（核蛋白）、E-cadherin、N-cadherin、vimentin，以GAPDH为内参、CDK4为β-catenin-N核内参。其余实验步骤，如：蛋白的提取、电泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相对表达量为：目的蛋白（ Capn4、β-catenin-T、E-cadherin、N-cadherin、vimentin）分别与内参蛋白（ GAPDH）灰度值之比；β-catenin-N与核内参蛋白（CDK4）灰度值之比，取每种细胞株3次试验的平均值做统计学分析（采用t检验，均数+标准差（SD）。P<0.05：差异有统计学意义）。　　结果：①黑色素瘤组织免疫组化染色计分方法：A：阳性细胞计分（0-3分）， B：组织中阳性细胞百分率计分（0-3分）。M：黑色素瘤组织阳性计分（0-9分）。计算式：分数值（M）=A× B。M：0-4分为低表达，5-9分为高表达。黑色素瘤组织中Capn4高表达率约为66.67%(80/120)，而正常组织标本中Capn4高表达率约为20.59%(7/34)，差异具有统计学意义（P<0.01）。②WB检测发现A375、M14、SK-MEL-1、MV3四种黑色素瘤细胞中Capn4的表达均高于正常细胞HaCaT中Capn4的表达。以Quantity one软件分析灰度值，Capn4在各黑色素瘤细胞系中的表达均显著高于在HaCaT细胞系中的表达，差异具有统计学意义（P<0.01）。③采用WB法，以GAPDH为内参，和对照组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3三个靶点均起到较好的干扰Capn4的效果，具有显著性差异（P﹤0.01）。其中shRNA1靶点效果最好，用shRNA1靶点进行后续实验。④采用WB法，以GAPDH为内参，和对照组相比，shRNA1可以显著降低M375/M14细胞中Capn4的表达（P﹤0.05）。以SPSS软件分析Quantity one软件所得的灰度值，Capn4在shRNA干扰的A375/M14细胞中的表达均显著低于对照组细胞（P<0.05）。shRNA1靶点干扰效果好且稳定，可以作为后续实验的干扰靶点。⑤实验组的OD值低于对照组。与对照组相比，shRNA干扰的A375及M14细胞均表现出低活性，差异具有统计学意义（P<0.05）。⑥干扰Capn4的A375/M14细胞的TUNEL阳性细胞百分比高于对照组（P﹤0.01）；Capn4干扰细胞中TUNEL片段多于对照组，DAPI染色提示shRNA转染细胞中细胞膜形态的变化多于对照组，TUNEL及DAPI原位融合支持上述结果。⑦采用WB法，以GAPDH为内参，Quantity one软件分析灰度值。和对照组相比，实验组的灰度值高于对照组。SPSS软件分析灰度值结果，和对照组相比，shRNA转染（干扰Capn4）可以显著增加M375/M14细胞中cleaved-caspase3蛋白的表达（P﹤0.01）。⑧Transwell小室实验发现，在侵袭实验及迁移实验中，Capn4干扰（ShRNA-转染）的A375/M14细胞，其侵袭及迁移数量均显著低于对照组，每组细胞取3次实验的平均值用于统计学分析，差异有统计学意义（P<0.05）。⑨和对照组相比，注射Capn4干扰细胞的实验组BALB/c鼠，肿瘤生长速度明显慢于对照组。取每组3只老鼠肿瘤体积的平均值，以t检验为统计学分析方法，差异具有统计学意义（P<0.05）。⑩采用WB法，以GAPDH为内参，和对照组相比，Capn4干扰（shRNA组，即shRNA1转染）可以显著降低M375/M14细胞中Capn4的表达（P﹤0.05）。　　结论：⑴Capn4在黑色素瘤组织及细胞中的表达显著高于正常组织及HaCaT细胞，shRNA转染的质粒可以干扰（下调）Capn4的表达。⑵干扰Capn4可以促进恶性黑色素瘤细胞凋亡，抑制恶性黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移以及成瘤能力。⑶Capn4可能是通过促进β-catenin从细胞质进入细胞核而不是通过增加总的β-catenin量来开启EMT进程。干扰Capn4可能是通过Wnt/β-catenin信号通路调控EMT、抑制黑色素瘤细胞侵袭、迁移。⑷Capn4可能是治疗恶性黑色素瘤的新靶点。