缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)长期以来一直被认为是影响肝脏移植预后的主要因素。虽然已知缺血再灌注会造成肝脏不可逆的损伤，但受限于缺血再灌注损伤复杂的机制，目前尚没有完全避免再灌注损伤的方法。然而越发明确的是在缺血再灌注损伤过程中，细胞的内质网(endoplasmic reticulum, ER)功能出现了紊乱。于是，ER应激逐渐被认为是IRI发生发展的又一诱因。中脑星形胶质细胞神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)是一种ER应激敏感蛋白，实验室前期研究显示缺血性脑损伤中MANF上调表达。虽然早期研究中MANF的功能研究主要是针对多巴胺能神经元和非多巴胺能神经元的神经保护作用。然而越来越多的研究显示，MANF对细胞凋亡和增殖具有调控作用，尤其是对足细胞、软骨细胞、胰腺细胞和视网膜神经节细胞均具有保护作用。然而，MANF对肝脏IRI的影响及相关机制尚无相关研究。
　　目的：
　　探究MANF蛋白如何影响小鼠肝脏IRI，并探究MANF影响肝脏IR的潜在机制。
　　方法：
　　为了研究MANF在IRI过程中的影响，我们使用了肝细胞特异性敲除MANF的基因敲除鼠(MANF hep-/-)和同窝出生的野生型小鼠(WT)。通过对肝门静脉部分夹闭,我们构建了70%IR模型，并且向干预组小鼠注射了MANF重组蛋白进行预处理。再灌注处理后我们对小鼠肝脏的细胞凋亡程度和凋亡蛋白的表达进行了检测。同时我们用AST、ALT、肝脏损伤面积以及Suzuki评分对各组小鼠的损伤情况进行了评估。体外实验中我们用小鼠的肝原代细胞进行了糖氧剥夺实验，在体外模拟了I/R过程。同时我们对MANFhep-/-鼠和WT鼠的原代肝细胞进行了转录组测序，寻找MANF敲除与相关信号通路的关联。我们还对肝脏组织进行了免疫组化和免疫荧光实验，对相关蛋白的表达和定位进行了检测。最后，我们运用CO-IP和质谱实验，检测并验证了潜在的可能与MANF结合的蛋白。
　　结果：
　　1.肝脏I/R损伤过程伴有MANF蛋白的上调表达
　　首先我们通过对建模后小鼠的AST、ALT进行检测，鉴定了70%I/R模型建立的成功与否。通过对造模后WT小鼠肝脏的MANF蛋白进行检测，我们可以发现经过三小时的再灌注处理即已经可以看见显著的MANF表达上调。通过HE和IHC实验，我们观察到MANF主要在损伤区域周边大量表达。
　　2.肝细胞MANF敲除加重了I/R损伤
　　我们用Westernblotting和PCR实验验证了肝细胞MANF敲除的效率，在肝脏组织中MANF几乎被完全敲除。造模后，我们对小鼠进行了AST、ALT检测和HE染色，结果显示，相比较于WT小鼠，MANFhep-/-小鼠的AST和ALT在再灌注3h和6h后均显著上调，相一致的是在对HE结果进行Suzuki损伤评估后，我们观察到MANFhep-/-小鼠相比较于WT小鼠显示出更严重的肝脏损伤
　　3.肝实质细胞MANF的敲除加重了肝脏I/R损伤造成的肝细胞凋亡
　　为了探究MANF蛋白是否影响I/R损伤后肝细胞的存活，我们从WT和MANFhep-/-小鼠中分离了原代肝细胞，并进行糖氧剥夺实验(Oxygen Glucose Deprivation，OGD)处理，同时检测MANF和AnnexinV的共定位。有趣的是我们发现膜上AnnexinV的表达与细胞MANF的表达呈相反关系，MANF高表达的细胞胞膜上的AnnexinV表达较少。TUNEL荧光实验结果也显示，MANFhep-/-小鼠与WT鼠相比显著增加原代肝细胞和肝组织中凋亡细胞的数量。通过对凋亡相关标志物Bcl-2、BAX和c-caspase-3进行westernblotting检测。我们发现与WT小鼠相比，MANFhep-/-小鼠中Bcl-2/BAX比例较低，而剪切型caspase-3水平较高。
　　4.重组MANF蛋白在肝脏I/R过程中可以通过抑制细胞的凋亡来保护肝细胞
　　为了证明MANF对I/R诱导的肝损伤具有保护作用，我们通过尾静脉向MANFhep-/-小鼠注射了(His-tagged)rhMANF。结果显示注射rhMANF可以显著的减轻了MANFhep-/-小鼠肝脏的I/R损伤。通过免疫组化的方法我们在肝组织中检测到了rhMANF的存在。并且我们在注射rhMANF后发现谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)显著减低，由此验证了rhMANF的保护作用。同时，rhMANF还增加了Bcl-2/BAX的比例，降低了肝组织中剪切型caspase-3的水平
　　5.MANF参与肝脏I/R诱导的非折叠蛋白反应
　　首先我们观察到内质网敏感指标BIP和CHOP在肝脏组织I/R后上调表达。表明I/R会诱导ER应激的发生。肝细胞特异性敲除MANF后，BIP和CHOP的表达上调，且在肝脏I/R损伤后进一步显著上调。这些结果表明，肝细胞中MANF的缺乏会引起ER应激。I/R后与WT小鼠相比，MANFhep-/-小鼠肝组织中的p-IRE1α、ATF4、ATF6的表达水平显著增加。这一结果同体外原代肝细胞OGD实验相一致。MANFhep-/-小鼠的原代肝细胞在经过OGD处理后的24小时内显著上调了p-IRE1α、ATF4、ATF6和BIP的表达水平。同时这些结果也表明，无论有无肝脏缺血再灌注损伤，肝细胞MANF敲除均可激活UPR信号通路，尤其是ATF4/CHOP通路。为了了解MANF能否能缓解MANF敲除的影响，我们将纯化的rhMANF蛋白用于MANFhep-/-小鼠。结果显示，与生理盐水组相比，rhMANF处理组BIP、p-IRE1α、ATF6和ATF4的表达均显著下调。所以我们认为MANF参与了组织I/R诱导的ER应激和UPR信号的激活。
　　6.肝细胞特异性敲除MANF激活了JNK/c-Jun/CHOP信号通路
　　我们通过对WT和MANFhep-/-小鼠的原代肝细胞进行转录组测序，结果发现了652个差异表达基因，其中448个基因上调表达，204个基因下调表达。通过对差异基因进行KEGG聚类分析我们发现，差异基因在主要集中在内质网蛋白加工途径和MAPK信号途径。其中HspA5(BIP)、Ddit3(CHOP)、JUN等重要伴侣分子和转录因子在MANF敲除的肝细胞中均上调表达，而JNUB、JUND、FOS的表达则无明显变化。这一结果表明，JNK/c-Jun的激活可能在MANFhep-/-小鼠I/R引发UPR的过程中起到重要作用。为了进一步验证JNK、Jun和CHOP的活化，我们用westernblotting和免疫组织化学方法测定了p-JNK、c-Jun、CHOP表达水平与定位。与WT小鼠相比，在MANFhep-/-小鼠中我们发现了p-JNK、c-Jun和CHOP表达水平升高。本结果提示，MANF敲除通过激活肝细胞中JNK/c-Jun/CHOP通路参与到了I/R诱导的肝损伤过程中。
　　7.MANF通过与GRP75相互作用调节其蛋白折叠功能
　　为了进一步探究MANF对UPR通路的直接影响，我们对CO-IP实验得到的蛋白溶液进行了质谱检测，结果发现MANF可以和GRP75结合。我们通过免疫荧光标记实验和westernblotting检测验证了两者之间的结合。并且在I/R后的肝脏中也发现两者的共定位，说明肝脏I/R损伤过程中存在MANF与GRP75的相互作用。通过对再灌注组织中的GRP75进行检测，我们发现小鼠再灌注损伤显著的上调了GRP75的表达，说明GRP75同BIP一样参与I/R损伤过程。并且经过I/R损伤后，MANFhep-/-肝组织中的GRP75表达水平显著高于WT肝组织。且线粒体非折叠蛋白反应的标志物CLPP在敲除MANF后也显著上调，说明了敲除MANF后可能会影响GRP75的生物活性，进而加重了内质网和线粒体的非折叠蛋白反应。
　　结论：
　　总结以上结果，肝脏I/R过程上调MANF的表达。MANF参与肝脏I/R过程并通过抑制内质网应激诱导的UPR反应减少凋亡蛋白的表达，同时肝细胞敲除MANF激活了JNK/c-Jun/CHOP通路，进一步加重了I/R造成的细胞凋亡。MANF还可能通过结合GRP75参与肝脏I/R产生的非折叠蛋白的处理过程。