论文部分内容阅读
目的研究临床分离的产酸克雷伯菌和阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药和/或敏感性降低的分子机制。方法临床分离到一株对碳青霉烯类抗生素耐药的产酸克雷伯菌ZC101和一株对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆菌ZY106。采用琼脂稀释法进行抗生素最低抑菌浓度（MIC）的测定。以大肠杆菌EC600或C600作为受体菌进行接合实验。等电聚焦电泳（IEF）检测产酸克雷伯菌ZC101、阴沟肠杆菌ZY106和它们的大肠杆菌接合子产β-内酰胺酶情况。PCR和DNA测序确定耐药基因的基因型。质粒消除实验证实外膜蛋白缺失是否可以引起对碳青霉烯类抗生素感性下降。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析产酸克雷伯菌ZC101外膜蛋白表达情况,并对OmpK35和OmpK36基因进行PCR扩增和DNA序列分析。Urea-SDS-PAGE分析阴沟肠杆菌ZY106的外膜蛋白表达情况。结果亚胺培南、美罗培南和厄他培南对产酸克雷伯菌ZC101的MIC分别为16μg/ml、16μg/ml和128μg/ml;对阴沟肠杆菌ZY106的MIC分别为2μg/ml、4μg/ml和16μg/ml。接合实验证实产酸克雷伯菌ZC101可将耐药质粒传递给受体菌大肠杆菌EC600,使其对碳青霉烯类抗生素的敏感性明显降低（MIC值至少上升4倍）。产酸克雷伯菌ZC101的blaIMP-4编码质粒被消除后菌株仍然对碳青酶烯类抗生物素有较高的耐药性。阴沟肠杆菌ZY106可将耐药质粒传递给大肠杆菌C600,使碳青霉烯类抗生素的MIC由接合前的≤0.0625μg/ml变为接合后的0.25μg/ml～0.5μg/ml。IEF、PCR扩增和序列分析证实ZC101产IMP-4型金属β-内酰胺酶和CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶,而转移接合子只产IMP-4。blaIMP-4基因位于大小约3000 bp的Ⅰ类整合子上,该整合子位于大小约55 kb的质粒上。同时证实ZY106中存在IMP-1型金属β-内酰胺酶和CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶,转移接合子只产IMP-1。ZY106还同时携带有质粒介导喹诺酮耐药基因qnrS1,将编码该基因的质粒通过接合试验转移到受体菌大肠杆菌EC600中可使后者对环丙沙星中介耐药（MIC:2μg/ml）,。质粒图谱分析发现blaIMP-1位于大小约50 kb的质粒上,qnrS1基因位于大小约60 kb的质粒上。产酸克雷伯菌ZC101外膜蛋白的SDS-PAGE和ompK35和ompK36基因序列分析发现ZC101由于ompK36基因中存在插入序列IS5而导致OmpK36膜孔蛋白缺失。对阴沟肠杆菌ZY106外膜蛋白进行Urea-SDS-PAGE分析发现有38 kDa蛋白的缺失。结论1、质粒介导的IMP-4型金属β-内酰胺酶合并OmpK36膜孔蛋白缺失是引起产酸克雷伯菌ZC101对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。2、质粒介导的IMP-1型金属β-内酰胺酶合并外膜蛋白缺失是引起阴沟肠杆菌ZY106对碳青霉烯类抗生素敏感性降低的主要原因,该菌株同时携带有质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS1。目的了解尿路感染细菌分布情况,分析尿路感染大肠杆菌的耐药性和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检出率,研究其对头孢菌素和喹诺酮类抗生素的耐药机制;了解尿道致病基因在其中的分布情况;通过HeLa细胞模型筛选尿道致病性大肠杆菌强毒株,分析其对HeLa细胞的致病性。方法回顾性调查浙江省59家医院2007年细菌分离状况,以及不同地区大肠杆菌ESBLs检出率和耐药性;同时回顾性调查我院2000年～2008年9年间,我院临床标本和尿液标本细菌分离情况、耐药性和ESBLs检出率,比较尿液分离大肠杆菌与不同标本来源的大肠杆菌的耐药性;采用特异性PCR检测耐药菌株的耐药基因,DNA测序后序列与GenBank中已知序列对比确定基因型和基因突变;采用PFGE分析菌株同源性,并通过PCR对尿路感染分离的大肠杆菌进行分子分型;采用PCR检测尿路感染患者分离的大肠杆菌的致病基因,分析致病基因的分布;通过黏附实验和胎盼兰染色对尿路感染患者分离的大肠杆菌进行强致病菌株的初步表型筛选,采用流式细胞术检测强致病菌株诱导HeLa细胞早期凋亡的能力,在电子显微镜观察细胞凋亡形态学改变。结果2007年浙江省59家医院调查结果显示,大肠杆菌的分离率处与首位;而且浙江省各地区大肠杆菌ESBLs检出率均在50%以上;对头孢菌素的耐药率在45%以上,对喹诺酮类抗生素耐药率最高,达60%以上;我院9年问回顾性调查显示,尿液分离的细菌中大肠杆菌连续九年都处于首位;大肠杆菌的ESBLs的检出率由2000年的7.2%上升到2008年的53.7%;头孢菌素的耐药率也由20%左右上升到50%以上,而环丙沙星和庆大霉素一直处于较高的耐药水平,耐药率分别为70%和60%左右。尿液分离的大肠杆菌的耐药性与其它标本来源的大肠杆菌比较显示,喹诺酮类抗生素和氨基糖苷类抗生素的耐药率基本相同,而尿液分离的大肠杆菌对头孢菌素的耐药率明显低于其它标本分离的大肠杆菌。通过病例查询,我们选定了28例住院患者,其尿常规检查白细胞均在2+以上,并且有尿路感染的症状。28株尿路感染患者分离的大肠埃希菌中,对头孢噻肟耐药率为64.29%,对环丙沙星的耐药率为71.43%。耐药基因PCR检测和DNA测序分析显示,同时携带CTX-M-15和CTX-M-14基因的有2株,只携带CTX-M-14的有16株。DNA测序分析喹诺酮耐药菌株gyrA和parC发现,在QRDRs存在突变。而且检测2株携带qnr基因,分别为qnrA1和qnrS1。PFGE结果显示,尿液分离的大肠杆菌同源性比较低,只有两株为同一克隆株,PCR分子分型显示以D型为主,占60.71%,其次为B2型,占35.71%。致病基因PCR检测阳性率最高的为Ⅰ型菌毛基因,为96.43%,只检测到6株usp基因阳性。通过致病表型筛选实验筛选到2株强致病性大肠埃希菌（6N和27N）,携带多种致病基因。其中6N菌株携带usp基因,而27N不携带usp基因,其它致病基因与6N相同。PCR分子分型显示,6N属于B2型,而27N属于D型。它们可以在3h破坏大量HeLa细胞,使HeLa死亡;流式细胞仪检测凋亡结果显示,6N菌株在1.5h可以诱导20.75%的HeLa细胞发生早期凋亡,而27N只有1.55%的HeLa细胞发生早期凋亡。电镜结果从形态学证实6N菌株可以快速引起HeLa细胞发生早期凋亡。结论1、大肠杆菌在细菌性感染中占有主要地位,尤其是在尿路细菌感染中。2、大肠杆菌产ESBLs是引起头孢菌素耐药的主要原因,ESBLs的主要基因型是CTX-M-14型。3、介导喹诺酮耐药的主要是gyrA和parC基因碱基突变引起,并且伴有qnr质粒介导的耐药。4、携带usp基因的强毒力株可以引起HeLa细胞快速早期凋亡。