1研究背景Graves病(Graves’ disease(GD))是一种多发于年轻女性的典型器官特异性自身免疫疾病。GD患者体内存在多种甲状腺组织特异的自身抗体,包括促甲状腺激素受体抗体(TRAb),甲状腺球蛋白抗体(TGAb)和甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb),这些抗体的存在是GD主要病理特征之一。其中TRAb是GD最关键的自身抗体,尤其是TRAb中的一种:甲状腺刺激性抗体(TSAb)。TSAb的存在是GD患者的特征,TSAb可以模拟促甲状腺激素(TSH)的作用通过刺激TSH受体直接引起甲状腺激素水平的升高,导致GD发生。GD致病因素和发病机制复杂,目前认为遗传因素发挥重要作用。然而,以GD为代表的自身免疫性甲状腺疾病(AITD)患病率在异卵双生子中只有3%-9%,同卵双生子也只有20%-40%,这表明环境因素在GD发病的过程中也起到关键作用,但其中的机制仍未完全阐明。调节性T细胞(Treg)是辅助性T细胞的重要亚群,在维持机体正常免疫稳态和免疫耐受中发挥关键作用。在系统性红斑狼疮、多发性硬化和炎性肠病等多种自身免疫性疾病中,Treg细胞的数量和/或功能都显著异常。作为典型的自身免疫性疾病,Treg细胞在GD的发生发展中也起关键作用。去除Treg细胞能显著增加小鼠自身免疫性疾病(包括自身免疫性甲状腺炎)的发生率,并加重病情。GD患者外周血和甲状腺组织中Treg细胞的数量明显下降,其功能也显著异常。辅助性T细胞17(Th17)是辅助性T细胞的另一重要亚群,能分泌促炎性细胞因子IL-17。Th17细胞与多发性硬化、类风湿关节炎和1型糖尿病等自身免疫性疾病的发病关系密切。然而,Th17细胞与GD之间的关系仍需要进一步研究阐明。Th17细胞和Treg细胞关系密切,相互影响,他们之间的平衡在免疫性疾病中起重要作用。但GD患者Th17细胞功能和数量异常的分子机制目前仍少见研究报道。为了填补GD患者体内Treg和Th17细胞异常的发生机制,需要进行更多深入的研究。肠道菌群作为人体的一部分,和机体互利共生。肠道菌群对机体健康影响深远,并且和很多疾病密切相关。近年来大量研究表明,作为重要的环境因素,肠道菌群在机体免疫系统发育以及功能调控中发挥重要作用。肠道菌群能调控肠道粘膜及肠道粘膜相关淋巴组织(Gut-associated lymphoid tissue,GALT)中包括Th17和Treg细胞在内的多种免疫炎症细胞,调节它们的发育、增殖和分化。不仅如此,多种肠道细菌及其代谢物或构成成分(如肽多糖)还能进入血液循环,调控肠道外组织/器官的Treg、Th17细胞的功能和增殖分化,还能调节免疫炎症。在肠道中,受菌群影响的Treg、Th17等免疫细胞也能进入血液,从而调控远端组织器官的免疫炎症。如肠道微生物Clostridiosis和Bacteroides产生的短链脂肪酸(Short-chainfattyacids,SCFAs)能直接或间接调节结肠及肠道外和循环中Treg和Th17细胞池的大小和功能。显然,这些研究结果清楚的表明肠道菌群在免疫调控中发挥关键作用,也和自身免疫耐受密切相关。因此,肠道菌群异常在自身免疫性疾病的发生发展中发挥关键作用。如肠道自身免疫性疾病包括克罗恩病(Crohn’sdisease)或溃疡性结肠炎与肠道中促炎性细菌Escherichia colistrains丰度增多及抑炎性细菌Faecalibacterium prausnitzii丰度减少密切相关。另外,多种肠道外自身免疫性疾病像系统性红斑狼疮、1型糖尿病、类风湿性关节炎和多发性硬化症也与肠道菌群失调密切相关。如风湿性关节炎早期患者肠道中Bifidobacteria和Bacteroidesfragilis显著减少而Prevotella coprii明显增多;肠道中Clostridiosis和Bacteroides fragilis对自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠有保护作用。这些研究结果都表明肠道菌群失调在自身免疫性疾病中尤其是Treg和Th17细胞异常中起重要作用。腹泻等胃肠道功能异常是GD的重要临床特点之一,常导致肠道菌群失调,造成Yersinia enterocolitica等肠道致病菌感染。很多研究表明Yersinia enterocolitica与GD关系密切,是GD发病的一个重要原因,但单纯用Yersinia enterocolitica喂饲并不能使小鼠发生GD。最近,一项研究报道了 GD患者肠道菌群的组成异常,并推测肠道菌群与GD之间存在关联。但是,该描述性研究并未深入研究探讨GD与肠道菌群之间的潜在机制。因此,考虑到人体肠道菌群与炎症和自身免疫的密切关系,就有一个很有意思的问题:GD患者的肠道菌群失调是否与其免疫调控异常(如Treg和Th17细胞的异常)有关?并且这个关系背后的机制是什么?需要更多的研究来解答上述问题。考虑到肠道菌群在免疫功能调控和自身免疫性疾病发病中的重要性,为了阐明上述问题,我们研究了 GD患者肠道微生物组的变化以及和免疫的关系。在该研究中,我们首先检测了 GD患者外周血中Treg和Th 17细胞比例的变化以及和肠道免疫的关系。然后利用16S rRNA基因二代测序技术以及靶向和非靶向代谢组学技术,通过整合分析这些组学与临床数据,发现肠道菌群及代谢物的异常与GD免疫异常的关系。我们发现GD患者肠道菌群组成及其代谢特征谱显著异常。肠道中脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)和丙酸含量与GD特征性的临床指标(血清TRAb)显著负相关。表明了肠道菌群异常和GD的密切关系。2研究目的(1)利用16S rRNA测序技术明确GD患者肠道中菌群组成及其异常改变特征。(2)利用靶向/非靶向代谢组学技术明确GD患者肠道代谢谱的变化特征。(3)在GD患者肠道中筛选与Treg和Th17细胞水平改变密切相关的异常肠道细菌和代谢物。3研究方法3.1临床样本收集:本研究入组58例初诊未治疗的GD患者(GD组)和63例健康对照人群(Control组)。禁食8小时后,早晨收集他们的粪便、血清及全血样本,粪便样本用于肠道菌群检测的研究,血清样本用于细胞因子及临床指标的检测研究,全血样本用于分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)及Treg和Th17细胞的检测研究。3.2肠道菌群检测:采用CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)法对粪便样本DNA进行提取从而获得肠道中菌群基因组DNA。使用二代测序技术对肠道中菌群的16SrRNA基因序列(V1-V2区)进行测序,通过QIIME1、USearch和Calypso等生物学分析软件得到肠道中菌群组成及变化。3.3肠道代谢物检测:通过非靶向代谢组学技术使用液质联用检测肠道中代谢物组成及其变化。通过靶向代谢组学技术使用气质联用检测肠道中SCFAs含量的变化。3.4多组学数据整合分析:将两组人群16S rRNA测序数据、代谢组学数据、临床指标等数据采用因子分析、特征选择和WGCNA等生物信息学方法以及多变量分析工具,整合分析上述数据,发现与GD密切相关的肠道细菌及代谢物。3.5流式分析免疫细胞变化:使用流式细胞仪检测外周血中Treg和Th17细胞的比例,以及CCR9阳性的Treg和Th17细胞的比例。3.6酶联免疫吸附实验(ELISA):使用ELISA检测血清中的下述细胞因子的含量变化:TGF-β、IL-10、sCD14、sCD25、IL-2、IL-17A、IL-1β、IL-6、IL-12 和IL-18。3.7实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR):检测两组肠道中Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度、生产SCFAs细菌含量变化,以及生产SCFAs的关键酶基因ButA、LcdA、PduP和MmdA的含量变化,使用细菌16S rRNA基因作为内参。3.8核酸凝胶电泳:检测健康对照人群、GD伴腹泻患者、GD不伴腹泻患者肠道中Yersinia enterocolitica感染情况。3.9统计学分析:使用软件SPSS 25.0和GraphPadPrism 8.0进行统计分析。首先用Shapiro-Wilk检验来检测数据的正态性。符合正态分布,数据用均数±标准差(mean±SD)表示,此时两组之间的比较使用t检验,多组之间的比较使用单因素方差分析并用事后检验(Turky或Dunnett)进行多重校正。不符合正态分布,数据用中位数±四分位间距(median±Interquartile range)表示,此时两组之间的比较使用Wilcoxon秩和检验,多组之间的比较使用Kruskal-Wallis检验并使用事后检验(Dunn或Steel-Dwass)进行多重矫正。对代谢组学数据和16S rRNA基因测序数据等组学数据进行多重比较或统计分析时,在FDR<5%条件下,使用Benjamini-Hochberg方法调整后的t检验或Wilcoxon秩和检验。对于分类变量的统计,使用卡方检验或Fisher精确检验。P<0.05或adjusted P<0.05表示有统计学差异。4实验结果4.1 GD患者外周血中免疫细胞比例及细胞因子含量发生明显改变,并且这种改变与肠道免疫密切相关我们通过流式细胞学技术检测了健康对照人群和GD患者外周血中Treg和Th17细胞数量比例的变化,发现GD患者外周血中Treg细胞明显减少而Th17细胞明显升高(P<0.05),导致GD患者体内Treg和Th17细胞平衡的紊乱,并且外周血中CCR9阳性的Treg及Th17细胞的变化和上面是一致的(P<0.05),CCR9阳性的免疫细胞表明来源于肠道或与肠道密切相关。并且GD患者外周血中的抑炎因子(TGF-β和IL-10)明显减少而促炎因子(sCD14、sCD25、IL-2、IL-17A、IL-1β、IL-6和IL-12)明显升高(P<0.05)。除此之外,在肠道免疫中起重要作用的细胞因子IL-18在GD患者外周血中也是明显升高的(P<0.05)。4.2 GD患者肠道中菌群组成及相互关系发生明显改变我们的16S rRNA测序结果表明GD患者肠道菌群组成发生了明显变化,菌群丰富度下降明显(P<0.05)。门水平分析发现GD患者肠道中Firmicutes的丰度是下降的而Bacteroidetes的丰度是升高的,我们使用qPCR技术也进一步验证了这部分结果。并且反映肠道菌群稳态的指标Firmicutes和Bacteroidetes的比值即F/B,在GD患者肠道中是降低的(P<0.05),表明了 GD患者肠道菌群的稳态是失衡的。并且生产SCFAs的菌群含量相比于健康人群是明显减少的(P<0.05)。人体肠道中菌群之间存在复杂的相互关系,相比于健康对照人群,GD患者肠道中菌群的相互作用也发生了明显的改变。通过和临床指标的相关性分析发现生产SCFAs的细菌和反映GD的临床指标(T3、T4、TSH和TRAb)密切相关。我们还使用了随机森林分析方法寻找生物标志物,其结果表明肠道中的三种菌属(Bacteroides、Alistipes和Prevotela)能够以85%的准确度区分鉴别GD患者和健康对照人群。这些结果充分说明了GD患者肠道菌群发生了明显的改变,并且这些变化和GD密切相关。4.3 GD患者肠道中代谢物组成发生明显改变肠道细菌作为肠道中代谢物的生产者和消耗者,肠道菌群和肠道代谢物密切相关,肠道中大部分代谢物的合成与降解都有肠道菌群的参与,变化的肠道菌群是否引起代谢物的改变,我们通过质谱分析肠道中代谢物,发现GD患者肠道中代谢物发生明显的改变。和健康对照组相比,GD患者肠道中的SCFAs(尤其是丙酸和丁酸)的含量明显降低(P<0.05)。而且对16S rRNA测序数据进行PICRUSt分析,其预测的结果表明在GD患者肠道中丙酸和丁酸代谢功能是下降的(P<0.05)。通过进一步分析肠道中代谢物和临床指标的相关性,发现GD患者肠道中差异代谢物中的SCFAs和临床指标(T3、T4、TSH和TRAb)有强相关性。4.4 SCFAs以及生产SCFAs的肠道菌属与GD临床数据密切相关肠道代谢物、肠道菌群和GD临床指标之间的相关性分析结果表明,丙酸和丁酸与肠道中生产SCFAs的菌属Roseburia、Bacteroides、Phascolarctobacterium成正相关。除此之外,在GD患者肠道中明显减少的丙酸和血清中的TPOAb、FT3、FT4以及TRAb成很强的负相关而与血清中的TSH成明显的正相关,这些结果表明丙酸和GD密切相关。我们通过检测肠道中细菌生产SCFAs过程中的关键酶基因丁酰辅酶A转移酶(ButA)、乳酰辅酶A脱水酶(LcdA)、丙醛脱氢酶(PduP)和甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(MmdA)的含量,也证实了 GD患者正是由于生产SCFAs的肠道细菌含量减少从而导致了肠道中SCFAs含量的减少。我们通过qPCR技术使用特异的引物确定了肠道中能够生产SCFAs的菌群相对含量变化,发现菌种Bacteroides fragilis和GD临床指标的相关性最强并且该菌种在GD患者肠道中下降程度最大(P<0.05)。以上结果表明肠道菌群异常(Bacteroides fragilis丰度下降)和菌群代谢物谱改变(丙酸含量降低)和GD关系密切。5结论(1)GD患者免疫功能存在明显异常,包括Treg细胞比例下降和Th17细胞比例升高,并且这种免疫改变和肠道关系密切。(2)GD患者肠道中菌群组成和谢物谱特征都发生明显改变,尤其是产SCFAs的肠道菌及SCFAs的含量都明显减少。(3)肠道中Bacteroides fragilis丰度下降以及丙酸含量降低与GD患者临床指标密切相关。1研究背景Graves病(GD)是一种多发于年轻女性的典型器官特异性自身免疫疾病。GD患者体内存在多种甲状腺组织特异的自身抗体,其中最重要的是促甲状腺激素受体抗体(TRAb)。TRAb的升高在GD发病中起重要作用。另外TRAb的异常与机体免疫状态密切相关,很多研究表明高水平的TRAb常常伴有外周血中Treg和Th17细胞数量和/或功能的异常。研究表明Treg和Th17细胞的异常可能在GD的发病过程中发挥重要作用,和GD的病情密切相关。然而,Treg和Th17细胞与GD之间关系及其背后的分子机制目前仍未完全阐明,仍需要进一步研究。人体肠道中存在复杂的微生物群落,称为肠道微生物群,它们通过共生关系与宿主共同进化。肠道微生物群在宿主免疫系统发育以及功能调控中发挥关键作用。大量研究表明,肠道微生物群与Th17和Treg细胞的平衡密切相关。Th17和Treg细胞是两个重要的T细胞亚群,具有相反的功能。代谢或免疫相关疾病中经常存在Th17和Treg细胞比例的异常,包括慢性炎症、过敏性疾病、自身免疫性疾病和癌症。因此,了解特定肠道微生物群与Th17和Treg细胞的平衡之间的关系,有助于更深入认识甚至治疗与这两种细胞失衡密切相关的一系列疾病。另外,已有研究表明Yersinia enterocolitica与GD关系密切,是GD发病的一个重要原因。考虑到人体肠道菌群的复杂性,以及与炎症和自身免疫的密切关系,我们认为肠道菌群因素影响GD的发病是一个复杂的过程,GD患者的肠道菌群失调与其免疫调控异常(如Treg和Th17细胞的异常)有关。但是这关系背后的机制目前还不清楚。短链脂肪酸(SCFAs)是不可消化的碳水化合物(NDC)通过肠道菌群发酵的主要终产物,包括乙酸、丙酸和丁酸等。越来越多的研究表明SCFAs与机体的健康密切相关。丁酸作为结肠细胞的首选燃料,是维持结肠上皮功能的重要物质。另外,SCFAs是游离脂肪酸受体2和3(FFAR2和FFAR3)的天然配体,在调控机体脂质代谢和能量稳态中起重要作用。而且,FFAR2和FFAR3在包括肠道内分泌和免疫细胞在内的多种细胞类型中都存在,提示SCFAs可能在调节免疫系统和炎症反应中起作用。最近,有2项研究强调了丙酸和丁酸通过抑制组蛋白脱乙酰酶(Histonedeacetylase,HDAC)在Treg细胞生产和功能中的作用。在以低度炎症为特征的代谢性疾病(例如2型糖尿病)中,已观察到生产丙酸盐的菌群数量的减少。因此,越来越多的证据支持SCFAs在塑造局部和外周免疫系统中起关键作用,通过炎症途径影响宿主的免疫稳态。Bacteroides属是人体肠道中含量最高的菌属,约占肠道中菌群的25%。而Bacteroides fragilis是Bacteroides属中最常见的组成之一。这种革兰氏阴性专性厌氧菌在人体肠道菌群中很常见,同时也存在于口腔、上呼吸道和女性生殖道中。越来越多的研究表明Bacteroides fragilis可能是人体肠道中的益生菌,并且Bacteroides fragilis和很多疾病都密切相关,其中包括2型糖尿病、高血压和肥胖等。另外,最近的研究还表明Bacteroides fragilis对机体正常的免疫状态至关重要。Bacteroides fragilis的荚膜成分多糖A(PSA)已被鉴定为一种免疫调节分子,在机体免疫系统发育成熟过程中起重要作用。此外,包括Bacteroides fragilis在内的肠道菌群还可以通过发酵膳食纤维产生SCFAs,SCFAs具有为结肠粘膜提供能量和维持结肠内环境稳定等有益功能。例如,口服补充Bacteroides fragilis可以明显增加沙门氏菌感染的大鼠肠道内容物中SCFAs的浓度,从而减轻炎症,恢复肠道屏障的完整性。肠道菌群尤其是Bacteroides fragilis对机体的免疫炎症有重要作用,但是还没有研究报道它们在GD发病中的作用。我们前期的研究发现GD患者肠道中Bacteroides fragilis的含量明显下降,而且与GD临床指标密切相关。考虑到肠道菌群在免疫炎症和自身免疫性疾病中的重要性,结合我们的前期研究结果,我们从人肠道中分离出脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis),并在细胞水平验证了 GD患者肠道中Bacteroides fragilis丰度降低引起的丙酸水平下降是GD患者Treg细胞含量降低,Th17细胞数量升高,Treg/Th17失衡的重要机制;并进一步通过粪菌移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)实验证实了肠道菌群的异常会促进GD的发病,而且补充Bacteroides fragilis能明显改善GD小鼠的免疫状态。2目的(1)研究肠道Bacteroides fragilis和丙酸在GD发病中的作用。(2)探究Bacteroides fragilis和丙酸调控Treg/Th17细胞的分子机制。(3)在小鼠GD模型中阐明肠道菌群失调与GD发病的因果关系。(4)探究Bacteroides fragilis对GD小鼠免疫状态及临床症状的改善作用。3研究方法3.1临床样本收集:本研究入组15例初诊未治疗的GD患者和13例健康对照人群。禁食8小时后,早晨收集他们的粪便样本和全血样本,粪便样本用于粪菌移植实验。从全血样本中分离PBMCs(Peripheral blood mononuclear cells)用于体外Bacteroides fragilis和丙酸对Treg和Th17的机制研究。3.2流式分析免疫细胞变化:使用流式细胞技术检测体外培养PBMCs以及小鼠外周血中Treg和Th 17细胞的比例变化。3.3 ELISA实验:ELISA检测小鼠血清及体外培养实验上清中的细胞因子及临床指标含量变化:IL-10、IL-17A、T4和TRAb。3.4肠道细菌分离培养:使用选择性培养基(M2GSC)从成年健康人粪便中分离得到Bacteroides fragilis YCH46菌株,并在厌氧环境下培养扩增。3.5实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR):检测健康人/GD患者肠道中Bacteroides fragilis YCH46菌株含量变化,使用细菌16SrRNA基因作为内参。检测Bacteroides fragilis YCH46菌株体外刺激健康人/GD患者PBMCs后FFAR2、HDAC6和HDAC9的mRNA表达变化,使用人β-actin(ACTB)作为内参。3.6细胞实验:Bacteroides fragilis YCH46菌株培养上清体外刺激健康人/GD患者PBMCs,观察Treg和Th17细胞分化情况以及其中可能的机制通路。3.7四联抗生素清除小鼠肠道菌群:使用四联抗生素(氨苄西林,新霉素,甲硝唑和万古霉素)对小鼠进行连续灌胃5天,并在小鼠饮用水中加入四联抗生素持续两周,达到清除小鼠肠道菌群的目的。3.8粪菌移植:收取健康对照人群和GD患者的新鲜粪便,PBS混匀后通过过滤制成细菌悬液,移植给抗生素清除肠道菌群的小鼠达到定植的目的。3.9肠道菌群测序:使用二代测序技术对粪菌移植实验中的供体、受体小鼠抗生素处理前后肠道中菌群的16S rRNA基因序列进行测序,通过QIIME2、USearch和Calypso等生物学分析软件得到肠道中菌群组成及变化。3.10 GD小鼠模型构建:使用腺病毒Ad-TSHR289构建GD小鼠模型,先抗生素处理小鼠得到清除肠道菌群的小鼠,再进行FMT使菌群定植,然后进行腺病毒注射,间隔三周注射一次,共注射两次,第二次腺病毒注射后三周检测小鼠血清中TT4和TRAb确定小鼠GD成模情况。3.11 Bacteroides fragilis YCH46菌株对GD小鼠免疫的影响:对GD成模小鼠灌胃补充Bacteroides fragilis YCH46菌株,观察不同处理组小鼠外周血中临床指标及免疫指标的变化。3.12统计学分析:使用SPSS 25.0和GraphPadPrism 8.0软件进行统计分析。首先用Shapiro-Wilk检验来检测数据的正态性。数据符合正态分布,数据用均数±标准差(mean±SD)表示,此时两组之间的比较使用t检验,多组之间的比较使用单因素方差分析并用事后检验(Turky或Dunnett)进行多重校正。数据不符合正态分布,数据用中位数±四分位间距(median±Interquartile range)表示,此时两组之间的比较使用Wilcoxon秩和检验,多组之间的比较使用Kruskal-Wallis检验并使用事后检验(Dunn或Steel-Dwass)进行多重矫正。对于分类变量的统计,使用卡方检验或Fisher精确检验。P<0.05或adjusted P<0.05表示有统计学差异。4实验结果4.1从肠道中分离Bacteroides fragilis并体外培养通过和临床指标的相关性分析得知能够生产SCFAs的一种肠道菌,Bacteroides fragilis与GD的关系最为密切(GD患者肠道中明显减少),所以我们使用选择性培养基M2GSC,在厌氧环境下从健康人新鲜粪便中成功分离得到菌株Bacteroides fragilis YCH46。并且通过RT-PCR 技术检测菌株 Bacteroides fragilis YCH46在GD患者肠道中的含量变化,发现该菌株含量在GD患者肠道中明显低于健康对照人群(P<0.05),和Bacteroides fragilis变化趋势是一致的。4.2 Bacteroides fragilis YCH46通过丙酸途径调节Treg和Th17细胞分化和生长体外细胞水平实验表明菌株Bacteroides fragilis YCH46培养上清能够明显增加PBMCs向Treg细胞转化同时抑制PBMCs向Th17细胞转化(P<0.05),这种作用在健康对照人群和GD患者的PBMCs中是都存在的。同时我们发现在Bacteroides fragilis YCH46刺激组,丙酸受体基因FFAR2的mRNA表达是升高的(P<0.05),而FFAR2下游分子组蛋白脱乙酰酶6和9(Histone deacetylase,HDAC6 和HDAC9)的 mRNA 表达是下降的(P<0.05),而HDAC6 和HDAC9 的作用正是抑制Treg细胞分化生长。这些结果表明Bacteroides fragilis YCH46是通过丙酸途径发挥调节Treg和Th17细胞的作用,从而调节Treg和Th17细胞的平衡。说明Bacteroides fragilis YCH46通过产生的丙酸发挥调节Treg和Th17细胞的作用。4.3在小鼠模型中通过FMT证明了肠道菌群的失调可以促进GD发病在使用腺病毒Ad-TSHR289造模过程中发现,移植GD患者肠道菌群的小鼠成模率高于移植正常健康人肠道菌群的小鼠(P<0.05)。并且在GD小鼠造模过程中,移植GD患者肠道菌群会增加小鼠血清中的IL-17含量同时降低血清中IL-10的含量(P<0.05)。这些结果说明肠道菌群作为一个环境因素可以促进小鼠GD的发病并加重小鼠免疫反应。4.4调节肠道菌群可以改善GD小鼠的免疫状态对GD小鼠进行菌株Bacteroides fragilis YCH46灌胃移植,发现在补充菌株Bacteroides fragilis YCH46后的第三周,会明显提高小鼠外周血中Treg细胞的比例同时降低Th17细胞的比例(P<0.05)。还会增加小鼠血清中的IL-10含量同时降低血清中IL-17A的含量(P<0.05)。虽然给GD小鼠在补充Bacteroides fragilis YCH46不能明显降低血清中临床指标(TT4和TRAb),但是这两项指标均是下降趋势。5结论(1)GD患者肠道中显著减少的菌株Bacteroides fragilis YCH46能通过产生丙酸调节Treg和Th17细胞的分化。(2)肠道菌群作为一个环境因素,在Ad-TSHR289的存在下,能明显提高小鼠GD的发病率。(3)补充菌株Bacteroides fragilis YCH46可以明显改善GD小鼠的免疫异常。(4)肠道菌群失调是GD发病的重要病因之一。