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化学农药给农业生产带来巨大经济效益的同时,由于施用不当或滥用农药也给环境造成多种污染,其中使用量最大、毒性较高的有机磷类杀虫剂和除草剂尤其如此。基于这种现状,本研究试图利用微生物源有机磷农药水解酶OPH的编码基因OPD,构建组成性表达载体和果实特异性表达载体,分别遗传转化番茄和黄瓜,通过基因工程提高它们降解有机磷农药残留的能力,以减少番茄和黄瓜中农药残留给人们的健康造成不良影响。获得如下研究结果。（1）表达载体构建与番茄瞬时表达分析构建了CaMV 35S驱动OPD的表达载体pSOP。克隆番茄果实特异性启动子E8,构建了E8驱动OPD的表达载体pSE8OP。在番茄果实中进行瞬时表达分析,证明OPD基因能够在番茄果实中获得表达。利用全波长扫描和荧光检测,亦证明番茄瞬时表达的OPH具有水解有机磷农药蝇毒磷的活性,最大酶活约11.59U/mg可溶性蛋白。建立的番茄瞬时表达系统,可以在1周左右快速有效地检测基因表达能力。（2）转基因黄瓜表达有机磷农药水解酶分析优选出津研4号黄瓜（Cucumis sativus L.Jinyan 4）的再生和转化条件。通过农杆菌介导,把35S-OPD表达元件转化到津研4号黄瓜中,筛选出9株Kan抗性转化苗,检测其中3株GUS阳性转化苗的叶片对有机磷农药蝇毒磷的降解能力,其中c-2株系的活性最高,酶活达到7.82μmol/mg·min,c-1株系的酶活为5.6μmol/mg·min,c-3株系的酶活为3.8μmnol/mg·min。首次通过表达有机磷农药水解酶OPH,提高了黄瓜降解有机磷农药的能力。（3）转基因番茄表达有机磷农药水解酶分析优选出Micro-Tom番茄（Solanum lycopersicum cv.Micro-Tom）的再生和转化条件。分别把35S-OPD和E8-OPD表达元件转化到Micro-Tom番茄中。通过GUS染色、PCR检测和Southern blotting分析,证明OPD基因已整合进转基因植株基因组中,具有1个拷贝。通过RT-PCR分析发现,E8驱动OPD基因在番茄果实中获得表达,但在叶片中未能检测到OPD基因的表达。通过检测不同时期果实中有机磷农药水解酶的活性,发现番茄在幼果期就表现出水解蝇毒磷活性,酶活达到43.8±4.5μmol/mg·min;青果期酶活是非转基因番茄的3倍以上,达到46.6±5.7μmol/mg·min;破色期酶活是非转基因番茄的12倍以上,达到101.0±4.3μmol/mg·min。转基因番茄OPH酶降解蝇毒磷的Vmax为2.73μmol/mg·min,Km为4.04μmol/L。比较转基因番茄和非转基因番茄对蝇毒磷的降解能力,结果表明非转基因番茄对蝇毒磷有很低的酶活性,转基因番茄通过表达有机磷农药水解酶OPH提高了对蝇毒磷的降解能力。首次通过在番茄果实中特异性表达OPH,提高了果实降解有机磷农药的能力,同时也不足以降低叶子上喷施农药的药效。（4）重组OPH酶性质分析转基因番茄重组表达OPH的最适反应温度为30℃,最适pH为9.0,温度稳定性高,70℃时仍保留54%的酶活;在Co2+存在时酶活最高,是天然Zn2+条件下酶活的2倍以上;易受到螯合剂EDTA和还原剂SDS、β-ME、TritonX-100和DTT的抑制;果实特异性表达OPH使番茄降解对硫磷的能力提高了2倍以上,降解毒死蜱能力提高了3-7倍,对乐果降解影响不明显。HPLC分析20μg/ml对硫磷或毒死蜱中浸泡24h后番茄的农药残留,结果表明转基因番茄叶子和果实中的对硫磷残留比非转基因番茄的分别少8.1%和40.0%,转基因番茄果实中毒死蜱残留比非转基因番茄的少40.6%,转基因番茄能显著提高有机磷农药残留的降解能力,并且具有果实特异性。重组OPH降解对硫磷的Vmax为1.17μxmol/mg·min,Km为11.15μmol/L;降解毒死蜱的Vmax为8.80μmol/mg·min,Km为5.91μmol/L。表现出与微生物源OPH不同的特征,可能与OPH翻译后修饰和定位有关。OPH翻译后有8个丝氨酸、6个苏氨酸和2个酪氨酸分别被磷酸化。这三种氨基酸往往是酶的活性中心,其磷酸化修饰会从结构到功能上影响OPH的活性和代谢模式。（5）OPH、GUS和NptⅡ潜在致敏性的生物信息学评估首次按照FAO/WHO决策方案和Codex指标,使用3大过敏原预测网站的现存数据和预测算法,对OPH、GUS和NptⅡ的潜在食品致敏性进行评估。在线Blast或Fasta比对分析发现,OPH、GUS和NptⅡ的全序列匹配性和连续80aa匹配性皆不存在致敏性可能。连续6aa匹配中,OPH有2个片段与大豆、小麦和橡胶树前纤维蛋白,以及德国蟑螂过敏原相关蛋白存在序列一致;GUS有1个片段与埃及伊蚊唾液腺过敏原存在序列一致;NptⅡ有1个片段与摇蚊血红蛋白过敏原存在序列一致,但匹配的6aa序列皆不在各蛋白抗原性决定部位。初步说明用于转基因植物表达的OPH、GUS和NptⅡ不具有潜在的致敏性风险。（6）降解有机磷乐果菌株的分离与鉴定经梯度富集和驯化,从贵阳花溪的农田土壤中,分离、筛选出两株具有降解有机磷农药乐果的真菌菌株F1和F2。比较分析发现,F1菌株降解乐果能力显著比F2菌株高,但是耐受性不如F2菌株。进一步分析三种碳源对F1菌株降解能力的影响,发现F1菌株在BM培养液中,能够快速降解100mg/L乐果,但是补充的碳源会延迟菌株对乐果的降解。经形态观察和rDNA ITS序列分析,证明F1菌株属于镰刀菌属（Fusarium sp.）。首次从贵州农田土壤中筛选出降解乐果的镰刀菌Fusarium sp.F1,为开发新颖的农药降解酶和降解基因用于进一步转基因植物培育奠定了基础。