目的:目前牙髓再生的方式有两种:干细胞移植和无细胞移植。两种方式各具优劣之处。研究已经证明无论是通过根尖损伤刺激出血,引导血液进入根管,还是通过在无髓根管内植入无细胞的趋化因子,均可诱导体内干细胞归巢到根管中,并形成新生组织。能否利用外泌体携带母细胞生物学特性的特点,用牙髓干细胞源性外泌体（DPSCs-EXO）替代牙髓干细胞（Dental pulp stem cells,DPSCs）移植,应用于非细胞移植形式的牙髓再生过程,替代后外泌体如何影响归巢的干细胞、牙髓再生的效果以及可能的作用机制是本研究的目的所在。本研究利用LPS作用于人牙髓干细胞（hDPSCs）,模拟hDPSCs在轻度炎症下的激活状态,收集该状态下的外泌体（L-EXO）,与hDPSCs在正常状态下分泌的外泌体（N-EXO）相比较,通过体内、体外研究,评价L-EXO的生物学特性和在牙髓再生过程中所发挥的生物学效应,并通过mi RNA差异基因分析进一步探讨N-EXO及L-EXO在牙髓再生中可能的分子生物学作用机制,为hDPSCs源性外泌体应用牙髓再生中提供科学依据。方法:1、组织贴壁法分离、培养hDPSCs,通过细胞形态学观察、诱导多向分化潜能、流式细胞仪检测干细胞表面标记物,对提取细胞进行鉴定。采用0.1μg/m L、1μg/m L、10μg/m L三种浓度的LPS,分别作用于hDPSCs 3天、5天、7天,检测LPS对hDPSCs生物学特性的影响:分别用CCK-8细胞增殖实验、流式细胞仪、Transwell小室及成骨、成脂诱导检测LPS处理前、后hDPSCs的增殖能力、凋亡情况、迁移能力和多向分化能力。2、采用超高速离心法和超滤法相结合提取外泌体,用纳米流式、透射电镜及蛋白印迹法（Western blot,WB）进行外泌体的鉴定,并检测L-EXO中残留的LPS。将L-EXO和N-EXO分别与BMSCs共培养,通过共聚焦显微镜、CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室、实时定量聚合酶链反应（Real time polymerase chain reaction,RT-PCR）、WB及成管实验评价骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）对两种外泌体的内吞情况及外泌体对BMSCs增殖能力、迁移能力、分化情况和成血管能力的影响。3、构建大鼠无髓根管模型,分别将L-EXO及N-EXO单独或联合BMSCs植入无髓根管内,术后30天取材,行HE、Masson和免疫荧光染色,对新生组织进行组织学评价。4、使用miRNeasy Mini Kit提取L-EXO和N-EXO中RNA,并通过Aligent2100对提取RNA进行质量检测。高通量测序检测L-EXO和N-EXO中mi RNA的表达情况,并分析差异表达mi RNA。用Target Scan、mi Randa软件对显著性差异的mi RNA分别进行靶基因预测,并进行GO功能注释和KEGG Pathway功能注释分析。用RT-PCR对测序结果进行初步检验。结果:1、从健康的牙髓组织中通过组织贴壁法分离提取了hDPSCs,分离的细胞呈长梭型,具有成骨向和成脂向多向分化能力,流式细胞仪检测干细胞表面标志物显示CD34、CD45均为阴性,CD29、CD90均为阳性,以P3-P5hDPSCs的干性特征明显。1μg/m L LPS作用于hDPSCs 3天组和5天组,hDPSCs增殖能力较对照组增强;0.1μg/m L 3d组、1μg/m L 5d组hDPSCs总凋亡率较对照组略有下降,0.1μg/m L3天组和1μg/m L 3d组保持较高的活细胞比例（＞90%）;1μg/m L和10μg/m L LPS作用3天组,hDPSCs的迁移能力较对照组增强。1μg/m L LPS处理组可以明显增强hDPSCs的成骨向分化的能力;LPS均抑制hDPSCs的成脂向分化。综合以上结果,1μg/m L LPS作用3天后的hDPSCs增殖、迁移能力增强、活细胞比例高。因此,1μg/m L LPS作用hDPSCs 3天可以使hDPSCs处于较好激活状态。2、超高速离心法和超滤法相结合可提取到纯度较高的外泌体,LPS作用后的hDPSCs较正常状态下外泌体的分泌量更大（p=0.048）。L-EXO中LPS的残留量符合国家和FDA应用于生物体内所要求的安全标准,可以应用于生物体内。共聚焦显微镜下证实BMSCs可以胞吞L-EXO及N-EXO,胞吞作用可以被PPIs明显减弱。L-EXO与N-EXO均可以提高BMSCs的增殖能力,但L-EXO处理7天后BMSCs仍能保持高的增殖能力。与N-EXO相比较,L-EXO可以更显著的提高BMSCs的迁移和分化,使CXCR4/SDF-1表达降低,VEGF、DSPP、ALP和Neurofascin表达水平均提高,成血管能力增强。3、L-EXO和N-EXO均可以促进根管内牙髓样组织再生,并减少单纯BMSCs植入根管后骨样/矿化组织的形成量,其中L-EXO组较N-EXO组新生组织中含有更丰富的血管,组织形态与正常牙髓组织更相似。免疫荧光结果提示:TGF-β可能在L-EXO和N-EXO参与的牙髓样组织再生过程中具有重要作用。4、经过质量检测,从L-EXO和N-EXO中提取的RNA均符合建库及测序要求。L-EXO与N-EXO的mi RNA测序筛选出9条具有显著差异的mi RNA,其中PC-5p-107456为全新mi RNA,数据库未收录。通过对差异mi RNA的KEGG和GO富集分析,发现这些mi RNA可能靶向多条细胞信号通路,这些信号通路参与血管再生、ECM重塑、炎症调控及神经损伤修复等生理过程,并可能在调控牙髓再生中起重要作用。RT-PCR结果显示L-EXO中mi RNA-31、mi RNA-30e、mi RNA-23b及PC-5p-107456较N-EXO上调,而mi RNA-2419和mi RNA-491下调,表达趋势与测序结果一致。结论:1、通过组织贴壁法成功分离提取hDPSCs,经细胞形态学、成骨向和成脂向分化潜能以及干细胞表明标志物等多项检测结果显示P3至P5hDPSCs具备良好干性。2、本研究分别用3个浓度的LPS作用hDPSCs 3d、5d和7d,结果显示1μg/m L的LPS作用3天为最适宜条件,hDPSCs的增殖、迁移及成骨向分化的能力增强。3、超高速离心法与超滤法相结合可提取纯度较高的外泌体,提取后L-EXO中LPS的残留量符合国家和FDA安全标准。LPS作用的hDPSCs分泌外泌体的量增加。4、BMSCs可以胞吞L-EXO及N-EXO,胞吞作用可以被PPIs明显减弱。L-EXO及N-EXO可以促进BMSCs的增殖、迁移、分化和成血管能力,与N-EXO相比较,L-EXO作用更明显且作用维持时间更持久。5、L-EXO及N-EXO均可促进根管内富含血管的牙髓样组织再生,减少BMSCs在根管内骨样/矿化组织的形成,与N-EXO相比较,L-EXO可促进更丰富的血管形成,新生组织的组织学结构与正常牙髓更接近。6、L-EXO与N-EXO的mi RNA差异基因表达分析,筛选出9条具有显著差异的mi RNA,其中PC-5p-107456为全新mi RNA,数据库未收录。对差异mi RNA的KEGG和GO富集分析结果显示:mi RNA可能靶向多条细胞信号通路,调控血管再生、ECM重塑、炎症及神经损伤修复等生理过程,并可能在牙髓再生中起重要调控作用。