第一部分:红霉素减轻NETs刺激引起的单核细胞糖皮质激素抵抗与PI3K/Akt/mTor通路相关基因有关目的:1.探讨中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）对慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases,COPD）单核细胞糖皮质激素抵抗的影响,以及红霉素对NETs引起的单核细胞糖皮质激素抵抗的影响。2.应用转录组学技术在全基因组层面观察NETs对U937细胞基因的影响,通过生物信息学技术挖掘与糖皮质激素抵抗相关的基因,探讨红霉素（Erythromycin,EM）调控NETs引起炎症反应及糖皮质激素抵抗的具体通路以及靶点。方法:1.首先分别从不吸烟的健康志愿者、吸烟的健康志愿者、COPD患者外周血中提取中性粒细胞以及单个核细胞,随后用烟草烟雾提取物（Cigarette smoke extract,CSE）诱导中性粒细胞产生NETs。使用50ng/ml终浓度的NETs分别刺激各自组提取出的单个核细胞,刺激到期后使用免疫蛋白印记（Westernblot,WB）检测各组中蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2,HDAC2）以及糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor,GR）的表达。2.研究NETs对人淋巴瘤单核细胞株U937细胞的作用,以及红霉素能否影响NETs的作用:实验分组:1.对照组（Control）;2.NETs组（NETs）:50ng/ml浓度NETs刺激U937细胞24小时;3.红霉素治疗组（EM+NETs）:1ug/ml浓度红霉素预孵育细胞24小时后,使用50ng/ml浓度NETs刺激U937细胞24小时。建模到期后,使用WB检测各组中HDAC2、GR蛋白表达。使用Trizol细胞裂解液裂解,上机行细胞转录组学检测。得到转录组结果后,使用R语言中Limma包、WGCNA包、GSEA软件等进行后续生信分析,查找与炎症反应特别是与糖皮质激素抵抗相关的基因或者信号通路。结果:1.COPD患者NETs刺激可以导致外周血单个核细胞Akt蛋白表达升高,HDAC2、GR蛋白表达下降,提示存在糖皮质激素抵抗。在体外实验中,NETs刺激导致U937单核细胞HDAC2、GR蛋白表达下降,抑制GR磷酸化。红霉素在U937单核细胞中可以减轻NETs刺激引起的HDAC2、GR蛋白表达下降,并能提高GR磷酸化水平。2.较之对照组细胞,50ng/ml浓度的NETs刺激能显著改变U937细胞转录组,激活多个炎症相关基因,红霉素治疗可扭转部分受NETs影响的m RNA表达。联合WGCNA结果以及GSEA、PPI网络中hub基因筛查,结果显示:红霉素主要通过以下通路调控NETs引起炎症,并改善NETs引起的糖皮质激素抵抗:PI3K-δ/Akt/mTor通路、IL-6/STAT3、NF-κB信号通路、p53、AP-1等通路及靶点。结论:1.NETs增加COPD患者单个核细胞中Akt活性,并抑制下游的HDAC2、GR活性导致糖皮质激素抵抗。红霉素可以上调被NETs所抑制的HDAC2、GR蛋白表达,并能提高GR磷酸化水平,改善糖皮质激素抵抗。2.NETs刺激可以导致U937细胞炎症反应及糖皮质激素抵抗,其机制是通过调控PI3K-δ/Akt/mTor通路、IL-6/STAT3、NF-κB信号通路、p53、AP-1等通路和靶点。3.红霉素可调控多个靶点影响NETs导致的U937细胞炎症反应,PI3K-δ/Akt/mTor通路、IL-6/STAT3、NF-κB信号通路、p53、AP-1通路是和炎症反应及糖皮质激素抵抗相关,PI3K-δ/Akt/mTor通路在这些基因中处于关键位置。第二部分:红霉素减轻NETs刺激引起的单核细胞糖皮质激素抵抗与PI3K/Akt/mTor通路相关蛋白有关目的:1.应用蛋白质组学技术在蛋白质层面探讨（1）NETs引起的糖皮质激素抵抗相关蛋白和通路及红霉素对上述蛋白或通路的影响。（2）联合蛋白质组学和转录组学研究NETs对U937细胞内炎症靶点m RNA及靶点蛋白的影响,并观察红霉素对炎症靶点的作用。2.通过Co-IP（Co-immunoprecipitation,Co-IP）联合质谱方法筛选与HDAC2存在直接关系的蛋白,验证蛋白质组学分析得到的相关蛋白。方法:1.蛋白质组学:细胞分组:1.对照组（Control）;2.NETs组（NETs）:50ng/ml浓度NETs刺激U937细胞24小时;3.红霉素治疗组（EM+NETs）:红霉素（1ug/ml）预孵育细胞24小时后,NETs（50ng/ml）刺激U937细胞24小时,之后裂解细胞送质谱仪行蛋白质组学检测。2.生物信息学分析:使用String数据库联合Cytoscape软件对Co-IP后质谱结果进行分析,建立PPI网络,并筛选其中的关键蛋白。使用Blast2GO Command Line、GSEA、KOALA（KEGG Orthology And Links Annotation）软件、Interpro数据库对差异蛋白质进行注释分析。通过Fisher精确检验（Fisher?s Exact Test）,比较各个分类、通路、目标蛋白质集合在总体蛋白质集合中的分布情况,来评价相关GO term、KEGG、GSEA通路蛋白质或功能结构域富集度的高低水平。并联合分析转录组学与蛋白质组学结果,查找二者是否存在共同通路。3.Co-IP联合质谱分析:使用RIPA细胞裂解U937细胞获得细胞蛋白,应用HDAC2抗体进行Co-IP,将沉淀得到的蛋白送质谱检测。4.使用String数据库联合Cytoscape软件分析Co-IP后质谱分析结果,筛选其中与HDAC2关系最为密切的蛋白,并将Co-IP后质谱分析结果与蛋白质组学分析得到的差异表达蛋白进行联合分析,验证差异表达蛋白是否与HDAC2蛋白存在相关性。结果:1.GO富集显示NETs刺激与革兰氏阳性菌和阴性菌的防御反应、脂多糖结合、细胞对脂多糖的反应等进程相关。同时GO富集也显示:红霉素干预后差异蛋白与C-X-C趋化因子结合、中性粒细胞脱颗粒、IL-1β分泌的正调控进程相关。KEGG富集分析显示红霉素调控NETs相关的活性氧产生以及溶酶体相关自噬过程。GSEA富集分析显示NETs与Control组中差异表达蛋白与P53通路、PI3KAkt/mTor通路、MYC相关靶点、炎症反应、凋亡、mTorc1通路有关,红霉素调控NETs引起的炎症反应与TNF-α/NF-k B、炎症反应、凋亡、mTorc1通路、PI3K-δ/Akt/mTor通路、IL-6/JAK/STAT3通路有关。红霉素调控NETs引起的蛋白质组学改变mTorc1通路、PI3K-δ/Akt/mTor通路、IL-6/JAK/STAT3、P53通路改变与转录组学结果一致。2.Co-IP联合质谱分析显示YWHAZ,HSPD1,ALB,PKM,HSPA8,EEF2,HSP90AA1,HSPA5,EEF1A1,RPSA,ANXA2,ACTB,TPI1,KRT19,ENO1,ACTA2,HSP90AB1,ATP5B,KRT8,HSPA9蛋白与HDAC2密切相关。3.联合Co-IP与蛋白质组学结果,显示RPS8、RPS16、PA2G4、LYZ、CTSZ、RPL24、HADH等多个差异表达蛋白与HDAC2形成蛋白复合物。结论:1.NETs刺激的U937细胞中,差异表达蛋白质的KEGG富集分析显示NETs引起的炎症反应可能与氧化应激以及溶酶体自噬相关途径相关,红霉素可以通过抑制氧化应激以及自噬抑制NETs引起的炎症反应。结合差异蛋白质的GSEA、KEGG、GO富集结果,并联合转录组学分析结果:在NETs刺激的U937细胞中,NETs引起的糖皮质激素抵抗与PI3K-δ/Akt/mTor通路、炎症反应相关性较大,红霉素抑制NETs引起的单核细胞糖皮质激素抵抗是通过抑制炎症反应、PI3K/Akt/mTor通路。2.U937细胞中蛋白YWHAZ,HSPD1,ALB,PKM,HSPA8,EEF2,HSP90AA1,HSPA5,EEF1A1,RPSA,ANXA2,ACTB,TPI1,KRT19,ENO1,ACTA2,HSP90AB1,ATP5B,KRT8,HSPA9参与调节HDAC2的表达。3.RPS8、RPS16、PA2G4、LYZ、CTSZ、RPL24、HADH等多个差异表达蛋白与HDAC2形成蛋白复合物,证明差异蛋白与HDAC2相关的糖皮质激素抵抗有关,并可能是红霉素抑制NETs诱导的糖皮质激素抵抗的中间靶点之一。第三部分:红霉素通过抑制PI3K-δ/Akt通路减轻NETs刺激引起的单核细胞糖皮质激素抵抗目的:为进一步验证前两部分组学结果及机制,在U937细胞中使用RT-PCR以及WB分别验证红霉素调控NETs引起的糖皮质抵抗相关靶点以及相关的炎症反应。方法:U937细胞验证:细胞分组:1.对照组（Control）;2.NETs组（NETs）:50ng/ml浓度NETs刺激U937细胞24小时;3.红霉素治疗组（EM+NETs）:1ug/ml浓度红霉素预孵育细胞24小时后,使用50ng/ml浓度NETs刺激U937细胞24小时;4.抑制剂组:PI3K-δ抑制剂IC87114组（IC87114）:1μmol/L刺激24小时,SIRT1抑制剂NAM组（NAM）:20mmol/L孵育24小时,MAPK抑制剂SP600125组（SP600125）:10mmol/L孵育24小时。建模到期后,以2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酯（2?,7?-dichlorofluorescin-diacetate,DCFH-DA,10m M）作为荧光探针,使用荧光显微镜观察各组细胞ROS释放水平。收集上清液用ELISA法检测各组中IL-8水平,提取总蛋白进行蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）验证,提取m RNA使用RT-PCR检测靶基因。结果:1.NETs刺激可以导致U937细胞内ROS释放增加,红霉素可以改善NETs引起的ROS释放。2.NETs刺激可以激活以Akt为核心的多个相关通路及靶点:如PI3K/Akt/mTor、AP-1、NLRP3、MAPK、IKK/NF-κB、SIRT1/PPARγ/PGC-1α,导致HDAC2、GR活性下降,降低GR磷酸化,并能观察到IL-8释放增加,炎症反应扩大。红霉素能扭转NETs刺激引起的Akt相关靶点活性改变,改善HDAC2、GR活性以及GR磷酸化水平。并减少IL-8释放,抑制炎症反应。结论:1.NETs可以引起氧化应激,促进U937细胞释放ROS,这可能是NETs激活炎症相关基因的机制之一。红霉素能抑制NETs引起的ROS释放,考虑这是红霉素存在抗氧化应激的作用。2.NETs刺激引起Akt相关通路及靶点的改变,并引发炎症反应,最终导致糖皮质激素抵抗,Akt为NETs相关糖皮质激素抵抗的一个关键靶点。红霉素可以通过抑制Akt的激活并作用于相关靶点,减轻NETs引起的糖皮质激素抵抗。