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帕金森疾病是一种常见的慢性中枢神经系统退化性疾病,主要影响运动神经系统。PINK1（PTEN诱导激酶1）,是帕金森疾病相关基因,因在PTEN过表达的情况下上调而得名。随后,PINK1报道其功能缺失型突变体发现与常染色体隐性帕金森有关。人PARK6基因编码含有581氨基酸的PINK1激酶,PINK1的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域高度保守,N-端含有自动调控序列和线粒体锚定序列。PINK1可以在受损的线粒体上累积并标记,以便清除受损线粒体,是线粒体自噬的第一个关键步骤。正常生理条件下,PINK1通过线粒体外膜的TOM复合体进入线粒体并固定于线粒体内膜的TIM复合体上。而PARL是线粒体内膜的一个水解酶,此酶在PINK1的丙氨酸103和苯丙氨酸104之间切割,产生52KD的N端缺失的PINK1片段。N端缺失的PINK1释放到胞浆中,根据N-末端法则,52KD的PINK1片段很快被蛋白酶体降解,这使得正常线粒体的上的PINK1含量和胞浆中的PINK1丰度极少。但是当线粒体受到损伤,线粒体膜电位发生去极化,PARL水解PINK1被抑制。PINK1得以在线粒体的外膜上累积,参与并介导线粒体自噬的发生。研究发现PINK1可以磷酸化修饰泛素分子S65位点,磷酸化的泛素（pS65-Ub）可以激活Parkin E3连接酶的活性。同样PINK1激酶活性亦可以直接磷酸化Parkin S65,此位点位于Parkin的UBL结构域中。Parkin是一种泛素连接酶,激活的Parkin可以泛素化线粒体外膜的多种蛋白,促使其经蛋白酶体途径降解,进而进一步诱导线粒体自噬。有丝分裂后期促进复合体（the anaphase-promoting complex,APC）在调控细胞周期进程,包括M期和G1期,发挥重要作用。为了完成此功能,APC核心体先后与两种不同的泛素连接酶结合（E3 Ligase）,Cdc20和Cdh1分别形成APCCdc20和APCCdh1两种功能相似,但是在不同阶段发挥功能的复合体。APCCdc20复合体在有丝分裂中期向有丝分裂后期的推进和整个有丝分裂期的结束起着关键作用。APCCdc20靶向有丝分裂过程中关键的细胞周期调控因子,例如Securin和cyclin B,使其发生泛素化降解。例如,Securin的降解可以促进染色体向两极运动。APCCdh1活性则开始于有丝分裂末期,并一直延续到G1早期。课题第一部分首先我们采取不同的方法同步化细胞细胞周期,例如胸腺嘧啶双阻断法,诺考达唑处理,血清饥饿法等,目的是使所有的细胞处于相同的细胞周期。课题中我们研究的APCCdc20和APCCdh1其含量是随细胞周期变化而波动的。细胞周期同步化释放后在不同的时间点收集细胞。免疫印迹检测参与线粒体自噬的不同蛋白含量变化。我们观察到PINK1的含量随细胞周期变化而波动。在G2/M期,处于最低,而此时APCCdc20的活性最高。联想到Cdc20本身是一种泛素连接酶,可以特异性识别含有D-box模序的蛋白,通过泛素化修饰底物后经泛素-蛋白酶体（UPS）途径降解。所以我们猜测PINK1很可能是Cdc20的底物,Cdc20通过泛素化降解PINK1而负向调节线粒体自噬。在293T细胞中过表达Cdc20,PINK1和泛素分子,发现与对照组相比Cdc20的过表达可以引起PINK1的泛素化升高和半衰期的缩短。免疫共沉淀检测二者存在相互作用。为了进一步验证我们的猜测,接下来我们采用慢病毒在Hela mt-Keima,YFPParkin细胞中稳定敲低Cdc20,经免疫印迹分析发现PINK1的含量有上调的趋势。接下来通过构建了含有不同截断的Cdc20的截断体,发现Cdc20的WD40repeats结构域可以识别PINK1中的D-box模序。论文最后为了验证我们的猜测:Cdc20的敲低通过上调PINK1的蛋白水平,促进线粒体的自噬。我们用碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）诱导线粒体自噬。CCCP是一种氧化磷酸化解偶联剂,可以使线粒体膜的通透性增高,进而使其膜电位发生去极化。在去极化的线粒体上PINK1得以累积磷酸化并激活泛素小分子,进而参与受损线粒体的清除。经过CCCP处理后检测线粒体自噬的相关指标,例如mt-Keima,线粒体内膜蛋白COX II,线粒体基质蛋白Hsp60。我们发现在Cdc20敲低通过提高PINK1蛋白丰度,促进线粒体自噬。