研究背景和研究目的肾上腺皮质肿瘤为临床上较多见的内分泌肿瘤,其中肾上腺皮质癌（Adrenocortical carcinoma,ACC）是导致患者死亡的重要原因。据报道,ACC的发病率约为0.7-2/100万。随着医学影像检测技术的推广,非肾上腺疾病检查发现肾上腺肿块越来越多,称之为肾上腺偶发瘤（Incidental adrenal tumor）,虽然肾上腺偶发瘤以良性和无功能居多,仍然有癌变和内分泌功能紊乱的风险。据国外报道,有些医疗中心发现肾上腺皮质癌可达到肾上腺偶发瘤的12%。目前对肾上腺偶发瘤的鉴别诊断无明确标准。在某些情况下通过临床特征或组织学标准很难准确地区分良性和恶性皮质肿瘤。精确的诊断非常重要,因为肾上腺皮质癌与肾上腺皮质腺瘤在预后、随访和治疗策略上完全不同。包括九点组织病理学标准的Weiss系统是目前最常用的评估恶性程度的金标准。然而,Weiss系统对于评分为3分的ACT在鉴别良恶性方面可能会出现偏差。肾上腺皮质癌多数恶性度高,容易发生侵袭及转移,预后不理想。早期病例予完整的手术切除是唯一有可能治愈癌肿的治疗方法。ACC手术患者的5年生存率约为32%-50%,且术后复发率较高。米托坦是药物治疗的主要基础,但回顾性研究认为米托坦作为辅助治疗仍存在争议,治疗应用困难主要是治疗窗口窄和毒副作用。其他形式的治疗,如化疗或放射治疗,对病人的生存影响有限,5年生存率低于30%。影响肾上腺皮质癌患者5年生存率的因素有以下几点:1.早期诊断的分子生物学标志物缺乏;2.目前缺乏有效的治疗中晚期肾上腺皮质癌的方法;3.提示预后的组织病理指标可信度欠佳;4.组织病理指标预后价值低;5.缺乏有效靶向治疗的分子标志物。筛选并鉴定肾上腺皮质癌关键生物标志物及有效靶向治疗靶点凸显其重要性。因此有必要探索新的分子标志物鉴别良恶性肾上腺皮质肿瘤并探索新的靶向治疗药物。应用生物信息学分析筛选肿瘤生物标志物及对于研究肿瘤发生发展的分子机制具有重大作用,生物信息学（Bioinformatics）是一门新兴的交叉学科。基因芯片（Gene chip）是一种快速、大量收集疾病遗传信息和基因表达谱数据的高新科技。只要生物信息学分析正确合理和统计学分析严谨科学,就可以方便、迅速挖掘到准确、符合统计学分析的结果。绞股蓝（Gynostemma pentaohyllum）是我国传统的中草药,绞股蓝皂苷（Gypenosides,GYP）是其主要的活性成分。研究发现其具有调节免疫力及抑制肿瘤、降血脂血糖、抗血栓保护心脑血管和护肝等多种作用。近年来关于绞股蓝与肿瘤关系的报道与日俱增,如肝癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、舌癌等,但有关绞股蓝与肾上腺皮质癌的研究较少。如何将传统中草药绞股蓝的优势和现代科学技术结合起来研发抗肿瘤药是当前研究的热点,以其为难治性肾上腺皮质癌患者带来希望的曙光。本研究应用生物信息学技术对基因表达数据平台（Gene expression omnibus,GEO）中肾上腺皮质癌和肾上腺皮质腺瘤表达谱进行统计分析筛选,找出差异性表达基因DTL（Denticleless Protein Homolog,DTL,又名CDT2,无齿状蛋白同源物）,为进一步研究做准备。由于DTL又名CDT2,游离型的DTL生物学作用尚未明确,目前研究主要研究结合型的DTL,即CRL4DTL是主要的E3泛素连接酶,DTL代表CRL4DTL的主要活性部分,故本论文出现的DTL、CDT2和CRL4CDT2视为同一概念,具有同样意义。然后进行人肾上腺皮质癌和肾上腺皮质腺瘤组织免疫组织化学染色验证DTL表达的差异,进一步用细胞实验进行验证,了解靶向干扰DTL基因和绞股蓝皂苷对ACC细胞的作用和可能机制。研究方法和结果第一部分通过生信分析的方法,应用微阵列技术筛选人肾上腺皮质癌与肾上腺皮质腺瘤的差异表达基因,数据来源于基因表达综合数据平台（Gene expression omnibus,GEO）,用DAVID数据库对DEGs进行基因本体论（Gene Ontology,GO）功能富集和KEGG通路富集分析,然后运行Cytoscape软件创建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络,并采用MCODE插件进行模块分析,接着用Cytohubba插件的4种算法拣选出核心基因。然后,核心基因的总体生存（OS）分析由Ualcan在线工具完成。结果从GEO共下载2个GSE,分别包括28个和55个病例。共获得115个DEGs,其中与正调控有关的DEGs显著富集在有丝分裂核分裂、浓缩的染色体着丝粒和蛋白激酶结合。与负调控有关的DEGs显著富集在心房肌细胞动作电位过程中的膜复极、细胞外的外泌体和肝素结合。KEGG通路分析表明显著的通路包括细胞周期、卵母细胞减数分裂和视黄醇的新陈代谢。PPI网络由109个节点和772条边组成。一个重要的模块在PPI网络中发现,其富集的功能和途径集中在有丝分裂核分裂、核浆、蛋白激酶结合和细胞周期。筛选出3个核心基因:DTL、TPX2、RAD51AP1,它们在ACC中均为高表达,且与ACC的预后相关。第二部分应用免疫组化法观察18例肾上腺皮质癌组织、31例肾上腺皮质腺瘤组织及8例癌旁正常组织中DTL蛋白的表达情况。结果发现:DTL蛋白主要定位于肾上腺皮质肿瘤组织的癌细胞胞核而在正常肾上腺皮质组织中基本不表达,DTL蛋白在肾上腺皮质癌组织中表达阳性率明显高于肾上腺皮质腺瘤（χ2=11.708,p＜0.05）和癌旁正常肾上腺皮质组织(（采用Fisher确切概率法,p＜0.01）。肾上腺皮质癌组织中DTL阳性表达占88.89%（16/18）,肾上腺皮质腺瘤中阳性为38.7%（12/31）。DTL蛋白表达量与肿瘤大小、浸润转移明显相关（采用等级资料的秩和检验,p＜0.05）,特别是肿瘤直径大于5cm者或有浸润转移者的DTL表达明显增加。而与患者性别、年龄及临床分期（基于TNM分期）均无显著相关性（采用等级资料的秩和检验,p＞0.05）。研究发现肾上腺皮质癌多侵犯包膜、邻近器官组织如肾脏、腹膜组织,亦有经过血液转移侵犯肾静脉、下腔静脉影响癌栓（Cancer embolus）形成并远处转移和定植。生存曲线使用Graphpad Prism7.0软件制作,两组生存曲线的差异用Log-rank检验进行比较分析,结果示DTL高表达组的生存时间较低表达组显著缩短,表明DTL蛋白低表达的肾上腺皮质癌患者手术预后情况更优（χ2=3.895,p=0.048）。结果发现DTL高表达组生存期是（26±7.2）月,而DTL低表达组的生存期是（76.3±8.2）月,肾上腺皮质癌DTL高表达组3年生存率不到30%,而DTL低表达组3年生存率超过80%。第三部分1.DTL RNA干扰序列的合成靶向干扰DTL的si RNA序列的合成。RNA干扰技术主要是导入特异性同源双链RNA,使靶基因不表达或表达减少。根据si RNA设计原理,本研究分别设计并合成了针对DTL的4条干扰序列。2.干扰DTL表达细胞的转染和干扰序列的筛选根据有效抑制DTL表达的si RNA序列,采用si RNA,分别构建DTL干扰细胞DTL si-1RNA、DTLsi-2RNA、DTL si-3RNA、DTLsi RNA。同时构建无同源位点的mock（mock si RNA）作为si RNA对照。RT-PCR结果显示:其中DTL si RNA序列抑制效率最高（vs.control组和mock组,t值分别为9.355和13.619,p值分别为0.001和0.000）,Mock-si RNA、DTL si-1和DTL si-3对DTL m RNA无明显抑制作用;Western blot检测显示:DTL si-1、DTL si-2、DTL si-3、DTL si RNA均对DTL蛋白表达有抑制,其中DTLsi RNA序列抑制效率最高;Western blot检测显示:DTL蛋白表达均被DTL si-1、DTL si-2、DTL si-3、DTL si RNA抑制,以DTL si RNA序列抑制效果最好（vs.mock,t=24.252,p=0.000）,同时发现,mock组和control组对DTL表达无统计学差异。综合考虑,选择DTL si RNA作为DTL干扰序列作为后续研究,mock组作为后续研究对照组。3.生长曲线法检测GYP对DTL敲减型或mock对照组SW-13细胞增殖的影响结果表明,SW-13细胞增殖可被DTL si RNA抑制;GYP对SW-13细胞增殖的抑制作用具有时间和浓度依赖性;DTL敲减型SW-13细胞增殖可被GYP抑制,抑制作用表现为时间依赖性,且较GYP于对照组抑制程度更强。以上说明DTL对SW-13细胞增殖过程具有重要促进作用。4.DTL干扰对GYP诱导SW-13细胞周期阻滞的影响DTL敲减后导致SW-13细胞S期阻滞;GYP作用于SW-13细胞可以导致其G2/M期阻滞;GYP作用于DTL敲减型SW-13细胞则导致细胞阻滞于S期和G2/M期。说明DTL干扰可增强GYP诱导SW-13细胞周期阻滞作用。为了进一步探讨DTL干扰对GYP诱导SW-13细胞周期阻滞相关蛋白的改变,我们利用RT-PCR和WB检测了GYP对DTL敲减型或mock对照组SW-13细胞DTL、P53、P21的m RNA和蛋白水平变化。结果显示:干扰DTL能上调P53和P21的表达（p值均＜0.05）,GYP能上调SW-13细胞P53和P21的表达（p值均＜0.05）,靶向干扰DTL可增强GYP对SW-13细胞P53和P21的表达（p值均＜0.05）。5.DTL干扰增强GYP诱导SW-13细胞凋亡为了进一步探究DTL干扰对GYP的增敏机制,本研究用FCM Annexin V/PI双染法检验细胞凋亡效果。结果表明:DTL si RNA可诱导SW-13细胞凋亡（vs.mock control,t=-10.457,p=0.000）,GYP可诱导SW-13细胞发生凋亡（vs.control,t=-6.61,p=0.003）,DTL干扰显著增强GYP诱导的细胞凋亡（GYP+si RNA vs.GYP,t=20.536,p=0.000）,这说明DTL干扰对GYP诱导凋亡有增敏作用。接着,我们利用RT-PCR和WB检测了GYP对DTL敲减型或mock对照组SW-13细胞Caspase 3和Caspase 9的m RNA和蛋白活化水平变化。结果显示:沉默DTL能显著上调SW-13细胞Caspase 3和Caspase 9的m RNA表达和其蛋白活化水平（p值均＜0.05）,GYP能显著上调SW-13细胞Caspase 3和Caspase 9的m RNA表达和其蛋白活化水平（p值均＜0.05）,靶向干扰DTL可增强GYP对SW-13细胞Caspase 3和Caspase 9的m RNA表达和其蛋白活化水平（p值均＜0.05）。结论GYP可诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。DTL si RNA可抑制SW-13细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡。GYP可上调细胞周期和细胞凋亡相关基因和蛋白的表达;DTL si RNA可上调细胞周期和细胞凋亡相关基因和蛋白的表达;靶向干扰DTL可增强GYP对SW-13细胞上调细胞周期和细胞凋亡相关基因和蛋白的表达。靶向干扰DTL可增强GYP对人ACC细胞的抗增殖、诱导细胞周期阻滞和诱导凋亡作用。本研究结果还提示,DTL可能是肾上腺皮质癌有前途的诊断和治疗靶标,DTL可作为绞股蓝皂苷抗肿瘤靶点进一步研究。