第一部分 外泌体生物标志物在卵巢癌诊断及预后评估方面的价值——系统评价目的:越来越多的研究表明外泌体生物标志物可作为卵巢癌诊断及预后的指标,我们将其诊断和预后评估方面的价值进行系统评价。方法:检索2019年12月20日之前发表的临床研究,从所有研究中提取外泌体的纯化和鉴定方法。在诊断方面,比较卵巢癌患者和健康女性外泌体生物标志物的表达情况。预后方面,研究外泌体生物标志物表达与总生存期（OS）,无进展生存期（PFS）之间的相关性。结果:共纳入文献1 1篇。外泌体提取试剂盒法是纯化外泌体的最常见方法,透射电子显微镜观察形态和检测外泌体标志蛋白是鉴定外泌体的基本方法。血清外泌体内miR-200a、miR-145显示出较高的诊断价值（miR-200a的 AUC=0.914,Sensitivity、Specificity 分别达到 83.9%和 90.0%;miR-145的 AUC=0.91,Sensitivity、Specificity 分别达到 91.7%和 75.0%）。血浆外泌体内含蛋白FGA、GSN、FGG也具有一定的诊断价值（血浆外泌体内含蛋白FGA、GSN、FGG 的 AUC 分别可达 84.59%、83.09%和 74.47%）。血清来源的外泌体miR-373、miR-200b、miR-200c高表达与OC患者的OS明显缩短密切相关（HR分别为2.1、2.7和2.4;95%CI分别为[1.0-4.3]、[1.3-5.7]和[1.2-4.9]）;miR-200c的高水平表达与OC患者的不良PFS也密切相关（HR=2.0;95%CI:[1.1-3.6]）。血清来源的外泌体长链非编码RNA aHIF与OC患者的不良OS密切相关（HR=3.70;95%CI:[1.83-7.50]）。血浆来源的外泌体蛋白标志物FGG和LBP的表达下调与OC患者的不良OS结局密切相关（HR[95%CI]分别为 0.79[0.69-0.91]、0.81[0.71-0.93]）,而且这两种外泌体蛋白标志物表达水平下调与OC患者的不良PFS结局也密切相关（HR[95%CI]分别为 0.77[0.67-0.89]、0.78[0.68-0.89]）。结论:外泌体生物标志物可用于卵巢癌患者的早期诊断和预后评估。第二部分 长非编码RNA共表达相关基因在上皮性卵巢癌的生物学作用--生物信息学分析目的:采用生物信息学的方法评估与长非编码RNA共表达相关基因在上皮性卵巢癌的生物学作用。方法:经过相关数据库检索、综合分析已发表的与卵巢癌恶性生物学行为有关的LncRNAs指标后,我们通过perl语言及R语言平台使用皮尔森相关系数（pearson correlation）和z-test检验目标LncRNA的表达水平与蛋白质编码基因（PCG）之间的相关性;通过检索Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取研究卵巢癌组织和正常卵巢组织的mRNA表达谱芯片数据集。利用在线工具venny对与目标LncRNA相关联的PCG和mRNA表达谱芯片数据集中获得的差异表达基因（DEGs）取交集,即获得了既与目标LncRNAs表达相关联同时又在卵巢癌中mRNA表达水平有差异的PCGs。随后分别对筛选出的PCGs使用DAVID进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析、使用STRING数据库进行PPI网络构建、Module及hub gene确定;对重要Module进行生物学功能分析、通路富集分析,展示hub gene之间相关性及对hub gene进行生存分析。结果:共获得 9 个 LncRNAs（分别是 LINC01088、SNHG3、SPRY4-IT1、CPS1-IT1、CDKN2B-AS1（又名 ANRIL）、MALAT1、FAM215A、LINC00472和HOTAIR）供我们与PCGs进行相关性研究。获得研究卵巢癌组织和正常卵巢组织的mRNA表达谱芯片数据集2个（GSE14407和GSE1852）。从 GSE14407,GSE18520 中分别识别出 2328 和 9590 个 DEGs。利用在线工具venny将GSE18520、GSE14407所得的共同表达DEGs与LncRNA共表达的PCG取交集得到与LncRNA共表达且属卵巢癌中差异表达的基因共1421个。GO分析表明共表达差异基因参与了 DNA replication、cell division、cell proliferation、extracellular exosome、protein binding 等功能富集过程;KEGG分析发现在这些共表达基因中有49个基因参与了pathways in cancer信号通路。满足与LncRNAs共表达且属卵巢癌中差异表达基因的PPI网络由979 nodes和5060 edges组成,随后筛选出重要module 2个（module中基因参与了与卵巢癌恶性生物学行为的相关过程）、hub gene共274个,hub gene之间显示出明显的互作关系。利用OncoLnc评估hub gene与OC患者预后相关性的情况后发现,高表达水平的CDCA3、BTRC、UBR4、IQGAP1、FBXL3、FGF2、SYT1、TRIM4、REPS1、AGFG1、PCNT、POLK、PTGER3和QKI与OC患者的总体生存率（OS）降低显著相关（p＜0.05）;低表达水平的 EXO1、MCM3、POLR2D、ANAPC11、SPC24、KLHL25、LSM4、PUF60和EIF3M与OC患者的OS降低显著相关（p＜0.05）。结论:与LncRNAs共表达且在卵巢癌中差异表达的蛋白质编码基因参与了卵巢癌的恶性增殖、病情进展及临床预后等生物学行为,这些结论可为我们挑选相关LncRNA指标扩大临床样本进行实验研究提供参考。第三部分 人体液来源外泌体通过其内容物之相关基因影响卵巢癌生物学行为——生物信息学分析目的:采用生物信息学的方法评估外泌体内容物（miRNA、LncRNA）靶基因在卵巢癌的生物学作用。方法:经过数据库检索、综合分析与卵巢癌恶性生物学行为有关的外泌体miRNA、LncRNAs指标,通过miRWalk数据库、perl语言及R语言平台使用皮尔森相关系数（pearson correlation）和z-test分别预测目标miRNA、目标LncRNA的蛋白编码（靶）基因（PCGs）;通过检索Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取研究卵巢癌组织和正常卵巢组织的mRNA表达谱芯片数据集。利用在线工具venny分别对miRNA靶基因、LncRNA共表达基因和mRNA表达谱芯片数据集中获得的差异表达基因（DEGs）取交集,即获得了既与目标miRNA或目标LncRNA表达相关联同时又在卵巢癌中差异表达的PCGs。随后分别对筛选出的PCGs使用DAVID进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析、使用STRING数据库进行PPI网络构建、Module及hub gene确定;对重要Module进行生物学功能分析、通路富集分析,展示hub gene之间相关性及对hub gene进行生存分析。结果:分别获得 3 个外泌体 miRNAs（miR-200a、miR-200b 和 miR-200c）、4 个外泌体 LncRNAs（LncRNAESRG、MEG3、MALAT1 和 UCA1）供我们与PCGs进行研究。获得研究卵巢癌组织和正常卵巢组织的mRNA表达谱芯片数据集 2 个（GSE14407 和 GSE1852）。从 GSE14407,GSE18520中分别识别出2328和9590个DEGs。利用在线工具venny将GSE18520、GSE14407所得的共同表达的DEGs分别与miRNA靶向、LncRNA共表达的PCGs取交集得到既与miRNA靶向、LncRNA共表达又属卵巢癌中差异表达的PCGs分别为1331、1113个。在与外泌体miRNA相关且属差异表达的PCGs中,GO分析表明大量PCGs 参与了 DNA 复制（DNA replication）、细胞分裂（cell division）、蛋白质结合（protein binding）、微管结合（microtubule binding）等功能富集过程。KEGG分析提示分别有28、58、33个基因参与了细胞周期调控通路（Cell cycle）、肿瘤信号通路（Pathways in cancer）和癌症蛋白多糖信号通路（Proteoglycans in cancer）。满足既是外泌体miRNA靶基因又属卵巢癌中差异表达PCG集合的PPI网络由1284 nodes和9879 edges组成,随后筛选出重要module 1个（module中较多基因参与了卵巢癌恶性生物学行为过程）,hub gene 256个（hub gene之间显示出明显的互作关系）。利用OncoLnc评估hub gene与OC患者预后相关性,结果表明高表达水平的IQGAP1、CDCA3、BTRC、UBR4、FBXL3、FGF2、SYT1、REPS1、PCNT、DOCK4、QKI与OC患者的不良OS结局密切相关（p＜0.05）;低表达水平的MCM3、POLR2D、ANAPC11、SPC24、LSM4、EXO1 与 OC 患者的不良 OS 结局密切相关（p＜0.05）。在与外泌体LncRNA相关且属差异表达的PCGs中,GO分析表明大量PCGs 参与了 微管细胞骨架（microtubule cytoskeleton）、DNA 复制（DNA replication）、蛋白质结合（proteinbinding）等功能富集过程;KEGG分析发现在这些共表达基因中分别有51、30个基因参与了肿瘤信号通路（Pathways in cancer）和细胞周期调控通路（Cell cycle）。满足既与LncRNAs共表达又属卵巢癌中差异表达PCGs集合的PPI网络由1065 nodes和7634 edges组成,随后筛选出重要module 2个（2个module中均有较多基因参与了卵巢癌恶性生物学行为过程）,hub gene 204个（hub gene之间显示出明显的互作关系）。利用OncoLnc评估hub gene与OC患者预后相关性,结果表明高表达水平的 IQGAP1、CDCA3、BTRC、UBR4、FBXL3、FGF2、SYT1、TRIM4、REPS1、AGFG1、PCNT、POLK、和 DOCK4 与 OC 患者的总体生存率（OS）降低显著有关（p＜0.05）;低表达水平的MCM3、POLR2D、ANAPC11、SPC24、KLHL25、LSM4、PUF60、EXO1 和 EIF3M 与 OC 患者的 OS 降低显著相关（p＜0.05）。结论:外泌体可通过其内容物之相关蛋白质编码基因参与卵巢癌的恶性增殖（细胞周期）、病情进展（迁移侵袭）及临床预后等生物学行为,这些结论可为我们进行相关实验研究提供线索。第四部分血清外泌体的制备及鉴定目的:分离纯化人血清外泌体,多角度评估所获外泌体质量,为下一阶段实验奠定基础。方法:收集人空腹静脉血血清,采用商品试剂盒法分离、纯化血清外泌体;利用透射电镜观察外泌体形态,Nanosight技术分析粒径分布;Western blot分析外泌体特异蛋白CD63、TSG101、CD81的表达情况。结果:透射电镜观察到的人血清外泌体外形呈圆形或椭圆形;Nanosight技术分析颗粒直径峰值为127.6 nm,直径30-150 nm之间颗粒占58.9%;Western blot证实外泌体提取悬液中能检测到标志蛋白CD63、TSG101、CD81的表达。结论:利用商品试剂盒法能提取到合格的外泌体,所得外泌体可用于下一步对外泌体中的差异LncRNA研究。第五部分血清外泌体LncRNA筛选及对上皮性卵巢癌临床诊断价值的初探目的:通过血清外泌体LncRNA测序挑选出在上皮性卵巢癌中表达差异明显的LncRANs进行临床样本QRT-PCR验证,分析单一目标LncRNA的诊断效能,通过Logistic二元回归模型构建诊断效能更高的多因子联合诊断模型。方法:1)选取上皮性卵巢癌患者4人及年龄大致匹配的健康女性3人,采集空腹静脉血清及分离血清外泌体。2)利用新一代测序技术分析上皮性卵巢癌患者和健康女性血清外泌体内差异表达的LncRNAs,并筛选出差异表达明显的LncRNAs。3)将所筛选出的差异明显的LncRNAs在原临床样本进行QRT-PCR验证。4)挑选经原血清样本证实的差异表达LncRNAs扩大临床样本进行QRT-PCR验证。5)绘制目标LncRNAs的ROC曲线,评价其敏感性和特异性等诊断效能。6)结合Logistic二元回归模型构建多因子联合诊断模型。结果:通过上皮性卵巢癌患者及健康女性血清外泌体内差异LncRNA表达水平比对,筛选出差异LncRNAs 425个（其中上调23个、下调402个）;挑选上下调表达异常明显的LncRNAs 6种（FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428）进行原样本验证,其结果表达方向一致。随后对这6种LncRNAs（FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428）进行大样本 QRT-PCR验证后发现,6种LncRNAs的AUC介于0.722-0.805之间,具有中等诊断价值。结合Logistic二元回归模型建立多指标联合诊断模型并绘制不同联合因子ROC曲线,结合其拟合结果,得出:联合因子预测模型1（由FER1L6-AS2;LINC01811 组成）、联合因子预测模型 2（由 CXXC4-AS1;LINC02343;LINC02428 组成）、联合因子预测模型 3（由 FER1L6-AS2;CXXC4-AS1;LINC02343;LINC02428 组成）的 AUC 分别为 0.865、0.934和0.962（三种联合因子预测模型诊断效能均高于单一 LncRNA诊断效能,p＜0.05）。结论:新一代测序技术是进行人血清外泌体差异LncRNA筛选的一种有效方法。单一指标 LncRNA FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、和LINC02428对上皮性卵巢癌是否发生具备中等诊断效能,多个LncRNAs联合预测模型的诊断效能明显高于单一LncRNA 指标。