蛋白酶是一类能够水解肽键的水解酶,广泛存在于动物、植物和微生物中,是一种极为丰富的酶。蛋白酶在许多生理生化过程中扮演着重要的角色,例如细胞周期过程,细胞信号传导,细胞增殖和凋亡,蛋白质运输和免疫反应等。蛋白酶是一种重要的工业酶,是第三大工业酶,已经应用于清洁剂、啤酒、肉类、皮革和乳产品很长时间了。目前应用于工业的蛋白酶存在着诸多的问题,比如热稳定性差,p H稳定相差,酶活力不理想等,因此具有极端抗逆的酶被优先使用,人们试图从生长于极端恶劣环境的微生物中获取。菌株Thermococcus kodakarensis KOD1是一种嗜热厌氧古菌,可在恶劣环境中生存,其体内存在的酶也具有一定的特性。本研究从古菌T.kodakarensis KOD1中克隆出了一种Tld D/Pmb A家族蛋白酶(TPP)基因Tk0499。为深入分析蛋白酶的结构和生化特性,我们主要做了以下的几个方面结果。1.克隆、表达和纯化古菌T.kodakarensis KOD1中蛋白酶TPP,并对其序列进行了分析。以古菌T.kodakarensis KOD1的基因组为模板,PCR扩增出1326bp大小的Tk0499基因,其ORF编码441个氨基酸,分子量大小48.5k Da。通过NCBI-Blast对其进行序列和同源性比对分析,该蛋白酶属于Tld D/Pmb A家族,为原核生物所特有,至今在真核生物中未发现该家族蛋白基因。构建其原核表达载体,利用BL21(DE3)表达系统,IPTG诱导表达得到目的蛋白酶,通过镍柱亲和层析对TPP进行纯化。2.TPP酶学特性分析。以酪蛋白为底物,与提纯的TPP混合,在适宜的温度和p H下孵育30min,取反应液进行SDA-PAGE凝胶电泳分析,发现TPP并没有水解酪蛋白的能力。TPP储存在4℃冰箱中数日,通过SDA-PAGE凝胶电泳分析发现有明显自我剪切的现象,并且自我剪切能力随着温度的升高而降低。这种自我剪切的过程在20d左右完成,形成大约44k Da的小分子蛋白,我们命名为S-TPP(Short-TPP)。我们对TPP和S-TPP进行了质谱分析显示TPP是通过剪切Ile25和Ile427两个位点形成的S-TPP。以酪蛋白为底物,与提纯的S-TPP混合,在适宜的温度和p H下孵育30min,取反应液进行SDA-PAGE凝胶电泳分析,发现S-TPP具有较强的水解酪蛋白的能力。3.TPP的酶活形式S-TPP的酶活特性鉴定。我们用同样的方法克隆、表达和纯化了S-TPP,以酪蛋白为底物进行酶活反应。通过SDA-PAGE凝胶电泳分析发现,克隆的S-TPP依然具有水解酪蛋白的能力。4.S-TPP的酶动力学研究。S-TPP通过在不同的温度和p H反应条件下与酪蛋白反应,我们发现S-TPP在温度40-60℃之间具有很高的酶活性质,在p H 5-9之间具有很高的酶活性质。在60℃加热1h依然能保持40%以上的酶活。总之,在本研究中,我们从古菌T.kodakarensis KOD1中克隆、表达并纯化了一个Tld D/Pmb A家族蛋白酶TPP,对其生化特性进行了分析与探索。结果表明没有水解酪蛋白能力的TPP在低温时通过自我剪切过程使之形成一个在高温度下具有水解酪蛋白能力的形式S-TPP。这些工作为深入分析蛋白酶的结构和生化特性奠定了基础。