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乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种天然活性铁结合糖蛋白,广泛存在于动物的乳汁、血液、唾液、汗液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中,其中在乳中(初乳)的含量高。乳铁蛋白具有多种生物学功能,是动物天然防御系统的重要成分,它除了参与铁离子的结合和转运,促进铁的吸收,还具有较强的抗微生物、抗氧化和促进免疫细胞生长等功能。因此乳铁蛋白作为在高效补铁剂、饲料添加剂、免疫调节剂以及抗氧化剂等具有广泛的应用前景,但传统的从初乳中分离纯化获得乳铁蛋白的方法工艺繁琐、成本高、产率低;而化学合成更加昂贵,难以达到临床应用和动物生产的需求,因此利用基因工程手段生产乳铁蛋白具有重要意义和广阔的应用前景。
猪乳铁蛋白(Procine Lactoferrin,PLF)由704个氨基酸组成,分子量约为80KD,由结构上基本相同的N-叶和C-叶以及中间连接组成,呈“二枚银杏叶”型结构,每叶都可结合一个Fe3+。N-叶由1-346氨基酸残基组成,分子量约38KD,研究表明其抗微生物功能的主要活性中心存在于N-叶的17-41位氨基酸残基,其作用机理一是夺取细菌生长所需的Fe3+而达到抑菌效果,二是粘附于细菌表面,改变膜通透性而直接杀菌。
毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来迅速发展起来的一种外源蛋白表达系统,兼有原核细胞的生长特性和分子遗传背景,以及真核生物的特性:既可以对外源蛋白进行蛋白质糖基化、二硫键形成等翻译后修饰,又可以在甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长,生长快、操作简单、成本低,从而利于有效表达出有生物活性的外源蛋白。
本实验根据猪乳铁蛋白N叶的序列,选用酵母偏嗜性密码子,设计并通过全基因合成方法合成猪乳铁蛋白N叶基因,将该基因定向插入表达载体pPICZαC质粒中,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZaC-PLF-N,送公司作测序鉴定,结果显示目的基因正确插入表达载体pPICZαC中。pPICZaC-PLF-N经Sac I单酶切后,通过电击穿孔转入分泌和蛋白酶缺陷性菌株毕赤酵母SMD1168内,接种于ZeocinTM选择性固体培养基,在温箱28℃中培养4天,得到高拷贝转化子,经PCR再次检测确定为阳性转化子。挑取ZeocinTM抗性的单独菌落在YPD液体培养基中培养,在AOX(醇氧化酶)启动子的调控下,PLF-N蛋白得到表达。收取上清液,作SDS-PAGE表达分析,考马斯亮蓝染色鉴定,得到一条约为38kDa的蛋白条带;用微量蛋白测定仪对蛋白含量进行测定,其上清液表达量为264μg/ml。对表达蛋白进行生物活性检测,抑菌实验结果显示表达蛋白对大肠杆菌DH5a和金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用。用液体生长抑制法测得表达蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为12.51μg/ml和25.0μg/ml。
综上所述,本实验成功在毕赤酵母中表达了PLF-N蛋白,并对其抑菌活性进行的初步测试,抑菌效果良好,为猪乳铁蛋白N-叶的工业化生产和在畜牧养殖业上应用奠定了一定的基础。