论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）也称猪蓝耳病,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种严重的病毒性传染病,该病以引起母猪的繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征。自1987年首次发现以来,该病广泛流行于世界各主要养猪国家和地区,已成为威胁养猪业的主要疫病之一。2006年以来,由该病毒变异株引起的高致病性猪蓝耳病（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HPPRRS）在我国广泛流行给养猪业带来了巨大的损失。包括灭活苗和弱毒苗在内的传统PRRS疫苗对HPPRRS只能起到部分保护作用,因此研制针对HPPRRS的高效的疫苗显得极为迫切。本实验室在研制HPPRRS常规疫苗的同时,也开展了利用基因工程技术构建表达HPPRRS病毒GP5的重组活载体疫苗,发挥此类疫苗多价并且可以作鉴别诊断的优点,探索基因工程疫苗作为HPPRRS常规疫苗的补充,为防治HPPRRS的生物制品提供更多的选择。GP5蛋白是PRRSV的主要囊膜糖蛋白,也是PRRSV重要的中和抗原,用含GP5基因的质粒DNA进行免疫,接种的猪产生了抗PRRSV的中和抗体,并可使接种猪在强毒攻击后得到有效保护。GP5基因在不同PRRSV毒株之间遗传变异较大。为了更清晰地了解PRRSV的遗传变异特征,本研究选取了PRRRSV的代表毒株和国内高致病性猪蓝耳病的代表株、及标准毒株HuN4株及其传代毒的GP5序列进行同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明:本文分析的我国分离株为北美洲型,且与2006年后我国分离的其它高致病性猪蓝耳病病毒GP5间存在较高的同源性,而与国内经典的流行毒株差异较大,且存在关键氨基酸的突变和一些规律性的点突变。本实验室已经构建的以伪狂犬病毒Bartha-K61株为载体表达PRRSV CH-1a株的GP5重组病毒,免疫猪后可以有效的抵抗PRRSV CH-1a株强毒的攻击。但由于HPPRRS病毒的GP5与PRRSV CH-1a株GP5氨基酸的同源性只有93%,影响了该重组病毒对HPPRRS的保护效果。因此,本研究通过构建表达HPPRRS病毒HuN4株GP5的重组伪狂犬病毒,为将来探讨其是否能够成为有效防制HPPRRS的疫苗奠定基础。本研究以经典的伪狂犬弱毒疫苗Bartha-K61株为载体,构建以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为选择标记的表达HPPRRS病毒HuN4株GP5的重组伪狂犬病毒。构建了含HPPRRS病毒GP5基因和EGFP报告基因的PRV转移载体,经酶切、PCR鉴定后为阳性的质粒命名为pgG-HPGP5-EGFP。将该质粒纯化后,采用LipofectaminTM2000瞬时转染293T细胞,转染后48h后EGFP表达效率最高。利用磷酸钙转染方法将质粒DNA和PRV Bartha-k61株的基因组共转染Vero细胞,转染后60～72h观察细胞病变,将带有绿色荧光病变的转染产物收获,从F2代开始采用蚀斑克隆的方法纯化重组病毒,经6轮蚀斑纯化,获得了稳定表达EGFP的重组病毒,我们将得到的重组病毒命名为rPRV-HPGP5。对第8代重组病毒进行PCR、Western blot和IFA鉴定。PCR扩增到了GP5基因并且重组病毒仍为gE缺失株,通过IFA和Western blot鉴定证实HPPRRS病毒HuN4株GP5基因得到了有效表达。