研究背景卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)定义为女性从青春期至40岁前出现卵巢功能的衰竭。可通过检测血清中促卵泡生成激素(FSH)>40IU/L、雌二醇(E2)<25pg/ml及卵巢组织病理切片提示大量的未成熟卵泡早期闭锁诊断。对应的临床表现为闭经、不育、及一系列低雌激素症状,如潮热、多汗、面部潮红、阴道干涩、性欲低下等。随着对卵巢中卵泡发生、发育、成熟及凋亡生命规律的研究,对POF的病因已有所了解。可将POF分为遗传性、酶缺陷、免疫性及医源性等。随着肿瘤患者的生存率提高,化疗药物所致的POF日益受到临床工作者的重视,防治化疗所致的卵巢功能损伤已成为研究POF的热点。化疗是临床上用于治疗恶性肿瘤和免疫相关疾病的重要手段,其特点为疗效确切,应用广泛,使得广大女性患者生存率得到很大程度的提高。化疗药物众多,铂类药物是一种临床上常用的广谱抗癌药物,顺铂(cisplatin,CDDP)是其代表药物。但因CDDP对靶细胞的选择性差,对肿瘤细胞杀伤的同时不可避免对正常细胞也有毒副作用。CDDP作用机制之一为与细胞DNA上的碱基结合,形成链间和链内交联,破坏DNA的功能,使DNA不能复制,达到治疗作用。肾毒性是CDDP最严重的毒副作用,但可通过水化、利尿等对症处理来减轻；而CDDP的生殖毒性研究相对较少,所以缺乏有效的处理措施,成为广大学者研究POF的焦点。在妇女一生中,卵细胞的储备在胎儿时期就已经确定并不可再生,平均每个妇女一生排出约400个成熟卵子。卵泡是由一个居于核心的卵母细胞及周围的颗粒细胞、卵泡膜细胞组成。自胎儿期5-6月起,卵泡就开始了它固有的生命规律：始基卵泡逐渐由初级卵泡,次级卵泡发育成窦前卵泡、窦状卵泡,最终发展成熟到排卵前卵泡。窦前卵泡是卵泡生长发育的关键阶段,其DNA复制十分活跃。有文献报道通过小鼠腹腔注射CDDP致卵巢损伤的动物模型,其病理结果提示卵巢内窦前卵泡早期闭锁明显增多。但哺乳动物体内的卵泡,受到自分泌和旁分泌的影响,其机制十分复杂。体外培养窦前卵泡时,可以很好的观察卵泡生长发育的过程,并可以较准确的观察CDDP对其的影响。近年来,研究发现干细胞(stem cells)具有自我复制、多向分化潜能、免疫排斥性低的特点,成为人类认识、分析、诊断及治疗多种疑难杂症的切入点。根据干细胞发育阶段及取材不同可以将干细胞分作胚胎干细胞和成体干细胞。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是成体干细胞的代表,它具有取材方便、培养及鉴定方法技术成熟、并且避免了伦理道德等问题,成为研究成体干细胞作用的首选。近年研究显示,MSCs可合成和分泌多种营养因子、细胞因子及特定条件下可诱导分化为终末细胞。MSCs与靶细胞共培养的方式,不仅可以观察MSCs本身的变化,还可了解靶细胞的变化。有文献报道,MSCs和肾小管上皮细胞共培养可以减轻CDDP所致的肾毒性作用。那么,MSCs和窦前卵泡共培养时是否可以减轻CDDP对窦前卵泡的形态及雌二醇(E2)作用的影响?这些都有待于我们进一步深入的研究和探讨。目的：1.为了研究CDDP对大鼠窦前卵泡的毒性作用,通过建立体外培养大鼠窦前卵泡系统,观察大鼠窦前卵泡形态学变化及培养液中E2浓度变化,探讨CDDP引起窦前卵泡早期闭锁的最低有效浓度。2.取第3代的MSCs和大鼠窦前卵泡共培养,观察大鼠窦前卵泡的形态学变化及培养液中E2浓度变化,探讨MSCs对大鼠窦前卵泡的生长发育有何作用。3.取第3代MSCs与CDDP所致的大鼠窦前卵泡损伤模型共培养,观察大鼠窦前卵泡的形态学及培养液中E2浓度的变化,探讨MSCs是否对CDDP所致的大鼠窦前卵泡损伤具有预防修复作用。方法：1.大鼠MSCs分离及原代培养大鼠麻醉后,无菌条件下取出胫骨和股骨,制备成单细胞悬液,1000rpm分离8min,弃上清,加入10%FBS的a-MEM培养液重悬细胞,按1×106个/ml将细胞接种至培养瓶中培养,用贴壁法纯化细胞；取第3代MSCs,制备成单细胞悬液,流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD45鉴定表面标志。该实验所用MSCs均为第3代细胞。2.建立大鼠窦前卵泡体外培养系统取已提前1天腹腔注射过孕马血清(PMSG:促性腺激素提取物,30IU/只)的12-14日龄雌性SD大鼠,脱颈椎处死后,无菌条件下获取双侧卵巢,投入含有a-MEM+10%胎牛血清的培养皿中,用连接在lml注射器的29G针头在40倍的体视显微镜下机械法分离卵泡。选择窦前卵泡的标准：直径为120-150μm,中央有一圆形卵母细胞,颗粒细胞透明,卵泡壁和基底膜清晰完整。将窦前卵泡用1ml注射器移入培养板内,每孔一个卵泡,加入lml由a-MEM+10%FCS+ITS(5μg/ml insulin,5μg/ml transferrine,5ng/ml selenium)+0.15mIU/ml hMG+1.5U/ml rhCG组成的窦前卵泡基础培养液,37℃、5%CO2、95%饱和湿度下培养24h。3.CDDP所致大鼠窦前卵泡损伤模型的建立将分离的60个大鼠窦前卵泡用1ml注射器移入培养板内,每孔一个窦前卵泡,分别加入基础培养液,在37℃、5%CO2、95%饱和湿度下培养24h。更换窦前卵泡基础培养液,并分为5组；分别加入CDDP浓度为0μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml,继续培养24h后,倒置显微镜下观察、记录大鼠窦前卵泡的直径,基底膜、卵泡轮廓和卵母细胞形态,有无颗粒细胞凋亡及卵母细胞逸出。收集加药培养24h后的培养液,用化学发光法检测培养液中的E2。Hoechst33342/PI对窦前卵泡染色后,荧光显微镜下观察窦前卵泡形态学变化并拍照。4.第3代MSCs与大鼠窦前卵泡共培养用1ml注射器将分离的大鼠窦前卵泡分别移入实验组及对照组内,每组各30个窦前卵泡。(1)实验组：取第3代MSCs按5×105个/ml接种于培养板内。吸去孔内的MSCs培养液,用PBS冲洗两遍,然后加入基础培养液,把分离好的窦前卵泡移入培养板内,每孔一个窦前卵泡。(2)对照组：先在培养板中每孔加入基础培养液,将分离好的窦前卵泡移入孔内,每孔一个窦前卵泡。37℃、5%CO2、95%饱和湿度下培养。加入窦前卵泡后满24h为共培养第1d,于第3d观察窦前卵泡,以后隔日换培养液,倒置显微镜下观察、记录大鼠窦前卵泡的直径,基底膜、卵泡轮廓和卵母细胞形态,有无颗粒细胞凋亡及卵母细胞逸出。并收集每次换下来的培养液,用化学发光法检测其中的E2浓度。5.第3代MSCs、CDDP与大鼠窦前卵泡共培养实验分为3组,每组各30个窦前卵泡：(1)实验组：取第3代MSCs按5×105个/ml接种于的培养板内。待MSCs贴壁生长后,将无菌条件下分离的大鼠窦前卵泡移入培养板内。共培养24h后换液,将1μg/ml CDDP加入窦前卵泡的基础培养液中；(2)实验对照组：将大鼠窦前卵泡移入基础培养液中,培养24h后换液,同样加入1μg/ml CDDP;(3)空白对照组：大鼠窦前卵泡移入基础培养液培养,不加入CDDP。实验组及实验对照组中的CDDP与大鼠窦前卵泡作用的时间均为24h,后换新鲜基础培养液。37℃、5%CO2、95%饱和湿度下培养,每隔1d换新鲜基础培养液;以加药当天为加药第1d,加药第3d、5d、7d时,倒置显微镜下观察、记录大鼠窦前卵泡的直径,基底膜、卵泡轮廓和卵母细胞形态,有无颗粒细胞凋亡及卵母细胞逸出。并收集每次换下来的培养液,用化学发光法检测其中的E2浓度。结果：1.大鼠MSCs的分离培养及鉴定培养72h后绝大部分细胞贴壁,形态变为梭形,呈集落样生长,折光性差,立体感不强。传2-3代后,细胞形态均一,为成纤维细胞样长梭形,排列有序。取第3代MSCs进行流式细胞仪鉴定。流式细胞仪结果表明90%以上的细胞CD29和CD44阳性,CD34和CD45阴性,证实为非造血干细胞的间充质干细胞。2.在建立CDDP所致窦前卵泡的损伤模型中,当CDDP浓度<1μg/ml时,光镜及Hoechst33342/PI荧光双染观察大鼠窦前卵泡与空白对照组无明显差别,培养液中E2的浓度无明显降低。当CDDP浓度为1μg/ml时,光镜下大鼠窦前卵泡直径变大,卵泡基底膜、卵泡轮廓不清晰,其内的卵母细胞形态模糊；荧光下有PI通过卵泡膜进入卵泡内与颗粒细胞胞核DNA结合。当CDDP浓度为2μg/ml时,大鼠窦前卵泡闭锁明显,光镜及荧光双染均观察到卵泡失去正常的组织结构,基底膜破裂,有颗粒细胞与卵母细胞逸出,培养液中E2的浓度明显降低。3.在MSCs与窦前卵泡共培养时,观察到大鼠窦前卵泡在体外培养可存活7d。共培养24h后,光镜下显示卵泡明显稳定,卵泡壁透明,卵母细胞清晰可见,位于卵泡中央,卵泡的体外培养时间可持续更长,结构较单独培养清晰,窦前卵泡出现变黑及卵泡膜破裂的现象较晚,并且在第7d有53.3%的卵母细胞有生发泡(GV)出现。单独培养的窦前卵泡在第5d有60%卵泡退化,光镜下见卵泡色泽变暗变黑、结构模糊,卵泡膜出现破裂,只有26.7%的卵母细胞在培养7d时有GV出现。在第3d、5d、7d的MSCs与窦前卵泡共培养液中,E2含量与对照组相比显著升高,差别有统计学意义。4.大鼠MSCs对CDDP所致的大鼠窦前卵泡损伤的影响(1)本实验观察时间共为7d。实验组中的大鼠窦前卵泡,卵泡壁透明,卵母细胞清晰可见,位于卵泡中央,与实验对照组及空白对照组相比,实验组中的窦前卵泡出现变黑及卵泡膜破裂的现象较晚,在第7d窦前卵泡稍微有些变黑,大多数卵泡轮廓还比较清晰,其内的卵母细胞也清晰可见。第3d、5d、7d实验组培养液中E2的含量与实验对照组及空白对照组相比明显升高,差别有统计学意义。(2)空白对照组在加药后第3d,窦前卵泡内稍微有些变黑,但卵泡基底膜、卵泡轮廓尚清晰完整,卵母细胞清晰可见,在加药后第7d,大多数窦前卵泡变黑、卵泡直径变大,卵泡轮廓不清晰,其内的卵母细胞形态模糊。(3)实验对照组在加药后第3d,窦前卵泡色泽就开始变暗变黑、卵泡基底膜、卵泡轮廓不清晰,并在第7d时大多数窦前卵泡变化明显,卵泡基底膜破裂,有颗粒细胞与卵母细胞逸出。结论：1.化疗药物CDDP对窦前卵泡有毒性作用,当CDDP的浓度为1μg/ml并与窦前卵泡共培养24h后,即可抑制大鼠窦前卵泡的生长,诱导窦前卵泡内卵母细胞、颗粒细胞及卵泡膜细胞出现凋亡,最终出现卵泡闭锁现象。大鼠窦前卵泡形态及E2水平出现明显变化,与人类CDDP导致的卵巢功能早衰的部分病变过程相似。2.MSCs与窦前卵泡共培养时,可提高体外培养的大鼠窦前卵泡存活率,卵泡中出现GV,说明MSCs可促进窦前卵泡中卵母细胞核进入增殖快速期,为减数分裂做准备,向优势卵泡发育。3.MSCs与大鼠窦前卵泡共培养24h后,将1μg/ml的CDDP加入培养液共同作用24h,观察到大鼠窦前卵泡出现闭锁的形态学变化时间晚,延长了体外存活的时间及提高了存活率,检测培养液中E2的浓度高,提示MSCs对1μg/ml的CDDP所致的大鼠窦前卵泡的损伤有预防保护作用。