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该论文的目的之一是在细胞毒性实验基础上,采用基因表达芯片技术和生物信息学研究方法,从基因组水平上探索Ni2+离子对细胞的分子毒性机理。首先采用ISO推荐的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法),研究了Ni-Ti合金以及Ti-6Al-4V合金在生理条件下可能析出的金属离子(Ni2+、Al3+和Ti4+)对小鼠结缔组织成纤维细胞L929细胞的细胞毒性。随后,根据上述MTT实验的结果,采用基因表达芯片技术,对浓度为200μmol/L的Ni2+离子作用后的L929细胞提取其总RNA进行基因表达芯片实验。并采用生物信息学方法,通过软件工具GenMAPP对Ni2+离子与L929细胞作用后14107个基因的表达情况进行了分析,筛选出了差异表达基因并分类。然后查询网络分子生物学数据库NCBI,利用查询得到的信息和文献,对Ni2+离子的毒性机理进行了初步探索,初步评价了其分子生物相容性。
该论文的目的之二是探索研究生物材料与机体相互作用的机理的新途径,为建立在基因组水平上进行生物材料安全性评价的新方法打下基础。
到目前为止,尚未见到利用基因表达芯片技术对Ni2+离子毒性机理进行研究的相关报道。
论文的工作如下:
1.采用MTT法评价了不同浓度的金属离子溶液(Ni2+和Al3+)以及Ti浸提液对L929细胞的细胞毒性。实验结果表明,Ni2+离子在较低的浓度下(100μmol/L)即表现出一定的细胞毒性,而且毒性随着溶液浓度的增加而增大,在最高实验浓度(500μmol/L)下,其细胞毒性达到了3级;Al3+离子在实验浓度下(100~1000μmol/L)未表现出明显的细胞毒性;Ti浸提液未表现出明显的细胞毒性。
2.根据MTT实验结果,选用200μmol/L浓度的Ni2+离子溶液,分别处理L929细胞不同的时间(24h,48h和72h)后,提取其细胞总RNA,同时还提取了正常细胞总RNA,并经质检合格,以用于基因表达芯片实验。
3.采用BioStarM-140s芯片(含14107个基因),分别以200μmol/LNi2+离子溶液处理24h、48h和72h后的细胞总RNA作为实验组,以正常细胞总RNA为对照组进行了基因表达芯片实验。每个实验组采用两张同型号的芯片在同样的实验条件下进行重复。实验结果表明,在24h、48h和72h实验组中发生了差异表达的基因数分别为:636个、1316个和1096个。
4.采用GenMAPP(GeneMicroArrayPathwayProfiler)软件对上述差异表达基因进行了分析,按照其GeneOntology(基因本体论)注释进行分类。按照各基因的Unigene查询号,在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)数据库中查询基因详细信息及相关文献。综合分析上述信息,对Ni2+离子的毒性机理进行了初步分析。