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副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是一种定殖于猪上呼吸道的常在细菌,在特定条件下可以引起副猪嗜血杆菌病,也称格拉泽氏病(Glsser’s disease)。该病以脑膜炎、多发性浆膜炎、关节炎为主要特征,严重危害各年龄段的猪群,病死率较高。HMGB1蛋白与各种感染性病原体的发病机制有关,在本研究中,我们探讨了副猪嗜血杆菌是否能够诱导猪外周血单核细胞分泌HMGB1,同时研究脂多糖(LPS)诱导仔猪后黄芩苷对HMGB1分泌的影响,通过RNA-seq测序分析副猪嗜血杆菌感染猪外周血单核细胞后相关信号通路的变化。1.副猪嗜血杆菌和脂多糖诱导仔猪HMGB1释放模型的建立。体外试验设空白对照组、LPS组、HPS组,诱导仔猪外周血单核细胞12h-48h;体内试验用LPS诱导仔猪0、3、6、9、12、24、36、48、72h后,采血分离血清以检测HMGB1的释放量。Western blot测定单核细胞培养上清液中HMGB1的表达,Q-RTPCR法测定单核细胞中HMGB1的mRNA表达情况,ELISA检测体内血清中HMGB1的含量。结果表明,副猪嗜血杆菌感染单核细胞后HMGB1的蛋白表达水平在36 h极显著增加(p<0.01),并且HMGB1的mRNA表达量在24h最高,此外,LPS还能诱导单核细胞HMGB1的mRNA在12、36、48h极显著增加(p<0.01);体内血清中ELISA结果表明,与对照相比,3h-48h HMGB1的分泌水平显著增加,HMGB1的释放在36h达到最高,然后在72h降低。2.黄芩苷对副猪嗜血杆菌体外感染猪单核细胞后HMGB1释放的影响。试验设空白对照组、副猪嗜血杆菌造模组、乙酰半胱氨酸(NAC)对照组、黄芩苷处理组(12.5、25、50、100 μg/mL)。药物处理组先加入相应浓度的黄芩苷及1 mM的NAC预处理1 h,再加入副猪嗜血杆菌感染单核细胞,共培养36、48h后收集细胞培养上清液,ELISA检测细胞培养上清液中HMGB1的含量:Q-RT PCR法测定细胞中HMGB1的mRNA表达情况;间接免疫荧光法测定HMGB1的核移位。结果表明,HPS感染单核细胞36 h后,HPS造模组与对照组相比,细胞培养上清液中HMGB1的释放量极显著升高(p<0.01),1 mM的NAC和12.5μg/mL的黄芩苷对HPS感染引起的单核细胞培养液中HMGB1的含量下调作用不显著,25、50、100μg/mL的黄芩苷可极显著地下调HMGB1的含量(p<0.01),HPS感染单核细胞48h后,HPS造模组与对照组相比,细胞培养上清液中HMGB1的释放量极显著升高(p<0.01),1 mM的NAC对HPS感染引起的单核细胞培养液中HMGB1的含量下调作用不显著,12.5 μg/mL的黄芩苷可显著地下调HMGB1的含量(p<0.05),25、50、100μg/mL的黄芩苷可极显著地下调HMGB1的含量(p<0.01);HPS感染单核细胞24h后,HPS造模组与对照组相比,单核细胞中HMGB1的mRNA表达水平极显著升高(p<0.01),1 mM的NAC对HMGB1的mRNA下调作用不显著,25、50、100μg/mL的黄芩苷可极显著地下调HMGB1的mRNA表达(p<0.01);间接免疫荧光结果表明,HPS造模组与空白对照组相比,HMGB1转运到细胞核外的数量明显增加,1mM的NAC对HMGB1的核转移有一定的抑制作用,12.5、25、50、100μg/mL的黄芩苷对HMGB1的核转移都有一定的抑制作用,且当黄芩苷浓度为10μg/mL时作用效果最显著。3.黄芩苷对脂多糖体内诱导仔猪后血清中HMGB1释放的影响。试验分为空白对照组和黄芩苷处理组。其中黄芩苷处理组是给仔猪注射LPS前2h按25 mg/kg肌内注射黄芩苷,每天给药两次,空白对照组只注射LPS。注射LPS之后在0、3、12、24、36、48、72h采血分离收集血清,ELISA检测各时间点血清中HMGB1的含量;72h后取脑部和肺部组织,用甲醛固定,制作石蜡切片,观察组织病理变化。结果表明,LPS刺激仔猪36 h后血清中HMGB1的含量达到最高,72h后降至正常水平,黄芩苷对LPS诱导的仔猪免疫应激反应中,抑制HMGB1的释放作用效果极显著(p<0.01);LPS注射组的仔猪表现出严重的急性炎症症状,但药物组的仔猪呈现轻微的反应,25 mg/kg注射黄芩苷可显著提高药物组仔猪的存活率。组织病理学观察结果显示,LPS组的仔猪肺脏呈现广泛的水肿,充血和严重的出血,成纤维细胞大量增殖并且细支气管充满大量的细胞渗出物,并且LPS组仔猪的脑实质充血,严重水肿。然而,经过黄芩苷处理的仔猪仅在脑和肺脏中观察到轻微的病理损伤。4.副猪嗜血杆菌感染仔猪单核细胞的转录组测序分析。分离猪外周血单核细胞,调整细胞浓度至1.O×106/mL。试验分空白对照组和HPS组(空白对照组:K1、K2、K3;HPS组:H1、H2、H3)。每个处理组做3个重复。每个重复取2 mL的细胞液培养于细胞培养单孔板中。空白对照组加入0.5mL的细胞培养基,HPS组加入0.5mL终浓度为1.0×106CFU/mL的HPS悬液。共培养24h后收集细胞,加入Trizol试剂,利用Hiseq 2500对cDNA进行RNA-seq。测序结果表明,副猪嗜血杆菌感染单核细胞24h后,共检测到982个基因发生了显着变化(倍数变化≥2,p<0.05),其中646个基因上调,336个基因下调;HPS组的HMGB1基因上调了 0.21倍;细胞因子-细胞因子受体相互作用,趋化因子信号通路和TNF信号通路在单核细胞感染过程中最为丰富。综上所述,副猪嗜血杆菌和脂多糖能诱导仔猪HMGB1的释放,黄芩苷能够抑制副猪嗜血杆菌和脂多糖诱导HMGB1的释放,并且能够提高LPS诱导的仔猪免疫应激反应中仔猪的存活率而发挥抗炎作用。本研究结果为黄芩苷用于预防和控制副猪嗜血杆菌的感染炎症提供一种新的方法。