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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是以干燥根及根茎入药的唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生药用草本植物,主要活性成分由脂溶性丹参酮类和水溶性酚酸类物质构成,是研究植物的次生代谢产物的理想材料,被称为模式药用植物。其中水溶性酚酸类物质被认为是丹参发挥药效的主要活性成分,其合成途径由酪氨酸和苯丙烷两条代谢途径共同参与构成。目前,应用基因工程手段增加丹参酚酸类物质含量已成为最近几年研究的热点。MYB转录因子家族除了影响植物生长发育外,还对植物初生以及次生代谢的调控发挥着重要作用,其中R2R3-MYB转录因子是MYB家族中数量最多、研究最广泛的一类转录因子。本实验室前期利用影响丹酚酸类物质合成的SmTTG1进行酵母筛库,获得一个R2R3-MYB转录因子SmMYB111,并初步推测SmMYB111影响着丹参中酚酸类物质的合成。鉴于此,本课题以丹参转录因子基因SmMYB111为研究对象,重点研究了SmMYB111转基因株系中的总酚酸、总黄酮、花青素、迷迭香酸和丹酚酸B含量的变化,并初步确定了 SmMYB111调控酚酸类物质合成的分子机理,该研究为通过基因工程手段提高丹参酚酸类物质的含量提供了理论基础。主要研究内容及结果如下:1.通过生物信息学方法对丹参R2R3-MYB转录因子基因SmMYB111的编码蛋白进行序列分析,发现其N端保守结构域存在与bHLH蛋白互作的保守基序[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R。蛋白序列多得序列比对和聚类分析发现,SmMYB111与调控黄酮类物质合成的VvMYBPA1、PtoMYB1 15和DkMYB4 同源性相对较高。基因结构图分析表明SmMYB111只含有1个内含子,保守性较高。初步推测SmMYB1 11可能参与苯丙烷次生代谢途径的调控。2.PCR扩增获得SmMYB111启动子区698 bp序列。PlantCARE在线网站对其分析发现,该启动子区除了含有非生物胁迫响应元件外,还含有MYB和bHLH类转录因子的结合位点。且丹参SmbHLH51启动子区也同时含有MBS和MBSⅡ两个MYB转录因子结合位点,推测SmMYB111不仅参与植物非生物胁迫的应答,还可能与SmbHLH51存在相互转录调控关系。3.丹参pet28a-SmMYB111的原核表达。考马斯亮蓝染色和Western Blot检测结果表明,丹·参SmMYB111蛋白相对分子质量大小为29.3 kDa左右,在37℃ IPTG诱导6h的条件下可大量表达,其中少部分在细胞内是可溶性蛋白,但大部分是包涵体,为后续对SmMYB111进行蛋白纯化提供了实验条件。4.构建SmMYB111过表达载体和干涉载体。通过浸染获得SmMYB111在丹参中的过表达和干涉转基因株系。经过DNA和RNA分子水平验证后各获得8株阳性转基因株系,最终根据SmMYB111在转基因株系中的表达量选取过表达株系(OM-1、OM-2)和干涉株系(iM-1、iM-2)各2株用于后续实验,为在丹参中研究SmMYB111的功能提供材料基础。5.SmMYB111转基因株系总酚酸、总黄酮和花青素的含量变化。过表达株系中总酚酸、总黄酮和花青素含量与对照株系相比具有显著性差异,其中OM-1和OM-2中总酚酸含量分别是对照株系的1.77和1.83倍,总黄酮含量分别是对照株系的1.92和1.57倍,花青素的含量分别是对照株系的1.80和1.63倍。在干涉株系中,总酚酸和总黄酮的含量与对照株系相比显著减少,花青素含量与对照相比无明显差异。说明丹参SmMYB111对丹参中总酚酸和总黄酮的含量起到促进作用。6.SmMYB111转基因株系中的迷迭香酸和丹酚酸B的含量测定。迷迭香酸在过表达株系OM-1和OM-2的含量分别是对照株系的3.03和3.05倍,丹酚酸B的含量分别是对照株系的3.26和2.36倍。干涉株系iM-1和iM-2中迷迭香酸和丹酚酸B的含量与对照株系相比显著减少,表明SmMYB111正调控丹参酚酸类物质的合成。7.丹参SmMYB111转基因株系中丹酚酸类物质合成通路16个酶基因的表达量测定。定量结果表明SmTAT1、Sm TAT2、SmPAL1、SmPAL3、SmC4H1、Sm4CL2、Sm4CL3、SmRAS1、SmRAS5和SmCYP98A14这10个酶基因在SmMYB111过表达株系中显著上调,而干涉株系则相反。说明SmMYB111转录因子通过激活丹酚酸类物质合成通路中SmTAT1,SmRAS5和SmCYP98A14等多个酶基因的表达,从而促进丹酚酸类物质在丹参中的积累。8.SmMYB1 11靶基因和转录调控活性的初步验证。对丹酚酸类物质合成途径酶基因启动子区MYB结合位点以及酶基因在SmMYB111转基因株系中的表达量分析后,利用酵母单杂交确定SmMYB111分别与SmTAT1和SmCYP98A14的启动子区互作。荧光素酶报告基因实验表明SmMYB111可激活SmTAT1和SmCYP98A14的表达。初步确定丹参SmMYB111的调控方式是SmMYB111直接结合并激活靶基因SmTA T1和SmCYP98A14,从而促进丹参酚酸类物质的积累。