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第一部分广西地区肌营养不良基因检测及突变谱研究目的应用肌营养不良（Muscular dystrophy,MD）的基因诊断流程进行诊断分析广西地区疑诊MD的患者,总结Duchenne/Becker型肌营养不良（Duehenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD）基因突变谱,分析基因型与表型的关系,提供精准的遗传咨询及产前诊断,为探索治疗的新方案建立基础,并加深对MD的认识。方法1.收集疑诊MD患者及家系成员的临床资料、实验室检查结果及血液样本。2.多重连接探针扩增（Multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）法检测疑诊MD患者的DMD基因,验证阳性患者的父母、同胞及母方家系成员,进行突变热点区域分析、断裂点分析、阅读框检测及外显子跳跃疗法适用性分析,并与其他区域检测数据进行比较。3.遗传性肌病Panel二代测序检测MLPA阴性的患者,对筛选出的阳性位点进行注释、分析及过滤,随后通过Sanger测序进行阳性位点的验证及家系分析。4.全外显子组测序（Whole-exome sequencing,WES）、全基因组测序（Whole-genome sequencing,WGS）或转录组测序（Massively parallel sequencing of RNA,RNA-seq）等其他方法进一步检测Panel结果阴性的患者。结果1.共纳入311例疑诊MD患者进行基因检测,294例（94.5%）确诊,其中274例（88.1%）DMD/BMD,20例（6.4%）其他类型的肌病（包括肢带型肌营养不良8例,Bethlem肌病3例,糖原累积症3例,脊肌萎缩症2例,Emery-Dreifuss肌营养不良2例,杆状体肌病1例）,另有17例（5.5%）未能在基因水平确诊。2.（1）MLPA检测出201例DMD基因外显子大片段突变的患者,诊断阳性率为64.6%（201/311）,其中4例为女性DMD患者;共有100种不同的外显子突变方式,其中137例患者为多个外显子缺失,最大的缺失片段是1-60号外显子,31例患者为单个外显子缺失,33例患者为大片段重复。（2）突变热点分析:大片段缺失的热点区域主要集中在45-54号外显子,以49号外显子受累最多;大片段重复的热点区域主要集中在2-13号外显子和46-50号外显子,以9号外显子受累最多。（3）断裂点分析:大片段缺失断裂点的热点区域为44-52号内含子,最常累及44号内含子;起始断裂点的热点区域为44-50号内含子,最常累及44号内含子;终止断裂点的热点区域为48-55号内含子,最常累及50号内含子。大片段重复的断裂点无明显热点区域,以1、2、7、44、45、62号内含子频数稍多,1号和2号内含子最多;起始断裂点较常累及1、2和45号内含子,1号内含子最多;终止断裂点较常累及2、9、13和62号内含子。（4）阅读框检测:201例大片段缺失和重复突变中,32例（15.9%）为框内突变,164例（81.6%）为框外突变,4例（2.5%）无法确认是框内还是框外突变。193例临床表型确定的大片段缺失和重复突变中,173例（89.6%）DMD/BMD患者符合阅读框规则。8例患者因年龄太小无法判断临床表型为DMD或BMD,无法判断是否符合阅读框规则。（5）外显子跳跃疗法适用性分析:28例DMD患者可能适用于51号外显子跳跃,24例患者可能适用于53号外显子跳跃,其中有4例52号外显子缺失的患者共同适用于51号和53号外显子跳跃疗法。共有48例患者可能适用于51号或53号外显子跳跃疗法,占所有外显子突变患者的28.6%,占所有DMD基因突变患者的17.5%。3.点突变检测:对110例MLPA结果阴性的患者进行遗传性肌病Panel二代测序检测,71例（64.5%）确诊为DMD基因的点突变,包含33例（46.5%）无义突变,5例（7.0%）错义突变,18例（25.4%）剪接突变,15例（21.1%）移码突变,与其他研究一致。其中40例（56.3%）为未报道过的新突变位点,经生物信息学软件预测均为致病性突变位点。4.携带者检测:204个DMD/BMD家系中的322例女性亲属进行了携带者的检测,其中138个（67.6%）家系中共检测出了180例（55.9%）女性携带者,有136例（66.7%）患者的基因突变遗传自母亲;另有2例患者母亲的血液样本基因检测阴性,但她们均连续生育了两例相同基因突变的子代,故被认为是疑似生殖腺嵌合携带者。结论1.MLPA检测DMD基因联合遗传性肌病Panel二代测序是目前疑诊MD患者的最佳基因检测策略。2.广西地区疑诊MD的患者以DMD/BMD为主,大片段缺失/重复突变是DMD基因占比最高的突变类型,DMD基因大片段突变以及断裂点的热点区域,与其他研究基本一致;广西地区89.6%的DMD/BMD患者符合阅读框规则,临床诊断及预后的预测应结合阅读框破坏情况及患者表型进行。3.广西地区DMD基因点突变以无义突变为主,40例点突变为新突变位点,突变形式包括无义突变、移码突变及剪接突变,丰富了DMD基因的突变谱。4.本研究有48例大片段缺失及33例无义突变的DMD患者可能适用于现有的基因疗法。5.广西地区66.7%的DMD患者的基因突变遗传自母亲,符合DMD的发病规律;临床医生和遗传学家在进行分子检测时应考虑生殖腺嵌合的可能性,降低相同基因突变患者在家系内再次出现的风险。第二部分复杂基因组重排致罕见型Xp21邻近基因缺失综合征的家系研究目的基于一个家系中两例同胞兄弟典型的DMD和先天性肾上腺皮质功能不全（Adrenal hypoplasia congenita,AHC）的临床表现,以及基因检测结果阴性的事实,应用WGS重分析技术辨识Xp21.2-3区域由复杂的断裂和倒位引起的新的重排事件,为一个罕见型Xp21邻近基因缺失综合征的家系提供基因层面的诊断。方法1.收集临床资料、实验室检查结果及血液样本。2.患者进行骨骼肌MRI、肌肉活检HE染色和dystrophin蛋白免疫组化染色、血清肌特异性mi RNAs、尿有机酸气相色谱-质谱分析（Gas chromatography-mass,GC-MS）、染色体微阵列分析（Chromosomal microarray analysis,CMA）、外周血染色体核型分析、MLPA检测DMD基因、遗传性肌病Panel二代测序、高精度临床外显子组测序以及两次全基因组测序（Whole-genome sequencing,WGS）检测,第2次WGS在建库时将插入片段的大小控制在350 bp左右。3.针对WGS筛选出的可疑阳性断裂点分析基因结构的改变,设计引物行PCR及Sanger测序验证,并分析对基因表达的影响,同时进行家系验证和共分离分析。结果1.2例男性患儿临床表现为进行性肌无力、轻度智力发育迟缓、Gowers征阳性、皮肤色素沉着和轻度失盐。实验室结果提示低钠、血浆皮质醇降低、ACTH增高,CK、CK-MB、ALT和AST升高,血糖和甘油三酯正常。Gesell智力测试量表提示智力发育迟缓。先证者母亲及两个姐姐的CK和CK-MB轻、中度增高,先证者父亲结果正常。2.两例患者的双下肢骨骼肌MRI结果提示大腿脂肪浸润主要累及臀大肌和大收肌,小腿脂肪浸润主要累及腓肠肌。患者母亲的股薄肌和缝匠肌有轻微的脂肪浸润,患者大姐的下肢骨骼肌无脂肪浸润和水肿。3.两例患者腓肠肌活检的HE染色显示明显的肌营养不良改变,dystrophin-N端、R端和C端抗体免疫组化染色显示肌膜dystrophin蛋白几乎完全缺失或完全缺失。4.两例患者血清mi R-499的相对表达量分别为10.46及56,均大于DMD患者的截断值4.715;CK联合miR-499预测先证者母亲为DMD携带者的概率值为0.949,大于截断值0.594。5.两例患者的尿有机酸GC-MS、CMA、外周血染色体核型分析、DMD基因的MLPA、遗传性肌病Panel二代测序、高精度临床外显子组测序以及第1次WGS结果均为阴性。6.第2次WGS结果显示先证者的Xp21染色体存在3个断裂点,分别位于无明确基因存在基因间区、NR0B1基因上游约1.6 kb以及DMD基因的第43号内含子中,导致Xp21.2-3区域的基因重排,破坏了DMD和NR0B1基因的结构,但保留了完整的GK基因。7.根据野生型序列及3处断裂点的上下游序列设计引物,对先证者及其家系成员进行PCR扩增。两个患者存在3处重排序列的扩增,而无野生型序列的扩增,两个姐姐和母亲同时存在3处重排序列的扩增和野生型序列的扩增,父亲仅存在野生型序列的扩增,上述结果通过了Sanger测序验证。结论1.Xp21染色体的复杂基因组重排（Complex genome rearrangements,CGRs）事件导致了两例患者DMD和AHC的表型,他们是该CGRs事件的半合子患者,两个姐姐和母亲均为杂合子携带者,父亲是无突变的野生型,遵循X-连锁隐性遗传模式,符合家系共分离。2.首次报告仅累及DMD和NR0B1基因,但不影响GK基因的CGRs事件,导致患者出现了DMD和AHC表型,但没有GKD表型的罕见型Xp21邻近基因缺失综合征。3.首次将mi R-499应用于DMD患者及携带者的协助诊断,进一步证明血清肌特异性mi RNAs协助辨识DMD患者和携带者的潜能。4.对常规基因检测结果为阴性但有较强临床表现证据的疑诊患者应进行基因检测的重新分析,有助于发现既往检测的缺陷及提高诊断效能;临床表型是选择基因检测方法的重要指标,当多种表型同时存在时,WGS可能是一种更经济有效的方法;改进WGS文库的插入片段大小可能有助于平衡结构变异的发现。