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目的:百草枯(paraquat,PQ)是一类国内常见的毒性很强的有机杂环类除草剂,其有效成分为1,1’-二甲基-4,4’-二联吡啶,临床上因误服和自服导致急性百草枯中毒患者日益增加,中毒患者的临床致死率高达85%-95%,且目前无特效解毒药。血液净化是临床上针对急性百草枯中毒最为常用的治疗手段,在诸多净化方式中,血液灌流(hemoperfusion,HP)是应用最为普遍的一种。由于PQ在人体内代谢较快,在人体内其分布主要位于肺、肝脏等组织器官中,血液中的分布极少,且PQ在体内经HP治疗后存在明显的“再分布”现象,因此在针对急性PQ中毒患者的临床治疗中,HP的运用时间及运用次数等具体运用方法存在诸多争议,其确切疗效在相关文献报道中也不一致。因此,本研究通过以比格犬为实验对象,进行PQ染毒后对其予以不同方案的HP治疗,观察记录并比较其血液中的毒物浓度,以探索对于急性PQ中毒患者在中毒初期行单次及二次HP治疗的确切毒物清除效果及意义,为临床救治提供一定的参考。方法:成年雄性健康比格犬18只,平均体重(9.31±1.07)kg。将18只比格犬随机分为3组:A组(单次HP治疗)、B组(两次HP治疗)及C组(对照组),每组6只。为避免经胃肠道染毒造成的吸收差异影响,本实验选择静脉染毒。将百草枯标准品按照10mg/ml溶于生理盐水中,配成相应溶液。经一系列预实验后确定了此浓度的染毒剂量可在保证达到重度中毒标准的同时实验犬又不会因中毒程度过重而致临床症状过重或死亡。所有比格犬均按照每kg体重2mg的剂量予以百草枯标准品注射,以15%的胃肠道吸收率及20%的常用农药浓度剂型计算,该剂量相当于口服常用农药中毒剂量达到46mg/ml,达到重度中毒标准。使用一次性使用静脉输液针经实验犬前肢外侧静脉注射PQ染毒。C组不予任何特殊处理,另两组行股静脉穿刺建立血管通路。为更加贴近临床患者诊治时间实际,A组在染毒后4h予以持续2h的HP治疗;B组在染毒后4h及10h分别予以持续2h的HP治疗,HP过程中予以肝素纳冲管抗凝,体外循环速度均为40ml/min,HP结束后予以鱼精蛋白对抗肝素,不予任何其他临床处理。采集、检测各组比格犬在染毒后0.5h、1h、2h、4h、6h、10h、12h、24h及48h血液中的毒物浓度,其中A组和B组4h和6h是首次HP前后采集的血液;B组10h、12h血液样本分别是第二次HP前后采集的血液。参照美国NKF-K/DOQ方法采集标本,行HP前采取上机前外周静脉血,HP下机后再采集标本,避免因生理盐水和肝素等对检测结果产生的影响,当通过留置导管采集血液时,先抽取血液5ml,再采集标本。采集的血液经3000r/min离心10min,取上清液置于-20℃冰箱中保存待测。采用百草枯表面增强拉曼光谱检测方法进行血浆毒物浓度的检测。所用基底为粒径50 nm的金纳米粒子(AuNPs),激光功率为60mW,单个样品信号采集时间10 s。配置标准曲线所需浓度的相应百草枯纯品样本,计算绘制相应的标准曲线,检测、计算并记录各实验样本的PQ浓度。统计分析采用SAS 9.2软件,计量资料数据以?x±s表示,统计分析方法采用混合效应模型,以P值<0.05为具有统计学差异。结果:(1)三组实验用犬在性别、体重上无统计学差异(P<0.05),所有实验用犬均未死亡,48h内亦未出现明显的呼吸困难等临床症状。(2)各时间点毒物浓度测量值比较结果:运用混合效应模型的方法对染毒后各时间点各组测得毒物浓度做组间差异比较。行HP治疗前各时间点,各组毒物浓度无统计学差异,染毒后6h,A组及B组结束首次HP治疗,毒物浓度明显低于C组(P<0.05),A组和B组毒物浓度无统计学差异(P>0.05);染毒后10h,各组浓度恢复至相似水平(P>0.05);染毒后12h,B组结束第二次HP治疗,毒物浓度明显低于A组及C组(P<0.05),A组和C组毒物浓度无统计学差异(P>0.05);染毒后24h,各组毒物浓度恢复至相似水平(P>0.05)。(3)各时间段毒物浓度下降程度比较结果:将染毒后4-6、10-12、2-6、2-12、2-24h测得毒物浓度做差值,观察各组在不同时间段的毒物浓度下降情况,并对各组间做两两差异性比较。A组和B组在首次HP前后毒物浓度平均下降了53.07%和50.35%,远大于同时间段C组的13.40%(P<0.05),A、B两组间无统计学差异(P>0.05);B组在第二次HP治疗前后,毒物浓度下降了67.39%,远大于同时间段A组和C组的3.38%和7.47%(P<0.05),A、C两组间无统计学差异(P>0.05);染毒后2h至染毒后24h,各组的下降程度均无统计学差异(P>0.05)。(4)各组毒代动力学比较结果:各组数据经药物代谢动力学分析软件winnonlin5.2.1版分析,得出各组比格犬百草枯毒代动力学参数。各组在峰浓度(maximum concentration,Cmax)、表观血浆半衰期(plasma half-life time,t1/2)、平均驻留时间(mean retention time,MRT)及药时曲线下面积(area under curve,AUC)经方差分析,均无统计学差异(P>0.05)。结论:经静脉染毒后,各组实验犬体内毒物浓度基本在相同时间段达峰,且峰值无统计学差异。经HP后,实验犬血液中毒物浓度均有明显下降,然后在较短时间内出现浓度的反弹上升,并恢复至与对照组相似水平。通过三组比格犬在AUC、t1/2、MRT的比较可知,中毒初期的单次或二次HP并不能有效改变PQ在体内的代谢。在行HP治疗的时间上,更早时间的HP治疗能更有效地降低药时曲线下面积,从而在减少血液中毒物方面达到更好的效果,而服毒较长时间后的HP治疗效果则极为有限;早期持续重复的HP治疗或可更加及时地清除血液中的百草枯,使血液中毒物浓度维持在较低水平。从本研究中PQ在比格犬体内的代谢趋势上分析,中毒后12h内的单次及二次HP治疗在灌流后短时间内可有效降低血液中的PQ浓度,而后迅速恢复至与未灌流组相似水平;说明血液中毒物剂量占进入体内毒物的比较较小,提示中毒初期单次或二次HP治疗不能明显改变体内PQ的毒物代谢。