第一部分Sc AAV9-h IGF1逆轴突靶向转染运动神经元的理论和实践目的:研究发现,AAV9可以通过外周给药逆轴突靶向转染脑和脊髓的神经元,而且自身互补双链AAV(sc AAV)比传统单链AAV转染效率高,蛋白表达速度快。本部分首先来验证1×1012vg/ml的AAV9-GFP和s c AAV9-h IGF1病毒载体是否能通过肌肉注射逆轴突靶向转染SOD1G93A A LS成年小鼠的运动神经元,并实现蛋白的持续表达,建立sc AAV9为载体、营养因子为基础的基因治疗,为进一步治疗肌萎缩侧索硬化提供可行的实验依据。方法:1随机选取60天龄成年SOD1G93A ALS小鼠,给予双侧腓肠肌一次性注射AAV9-GFP病毒载体,10ul/肌,即1×1010vg/肌。三周后,麻醉处死动物,冰冻切片,在荧光显微镜下直接观察肌肉和脊髓的绿色荧光蛋白(GFP)的表达。2选取60天龄成年SOD1G93AALS小鼠,随机分为空白对照组(control组,n=15)和,AAV9-GFP组给予一次性肌肉注射AAV9-GFP 10ul/肌,即1×1010vg/肌,注射肌肉包括双侧的咬肌、肱二头肌、肱三头肌、肋间肌、腹肌、股二头肌、股四头肌、腓肠肌,n=15,每天观察两组动物发病时间和生存期。用蛋白印迹技术方法检测终末期两组小鼠GFP蛋白的表达。3随机选取60天龄成年SOD1G93A ALS小鼠,给予双侧腓肠肌一次性注射sc AAV9-h IGF1病毒载体,10ul/肌,即1×1010vg/肌,n=3。三周后,麻醉,多聚甲醛灌注,取小鼠脊髓腰膨大组织,运用免疫荧光技术在荧光显微镜下观察腰髓前角运动神经元sc AAV9-h IGF1逆轴突靶向转染神经元及h IGF1蛋白的表达情况。4随机选取60天龄成年SOD1G93A ALS小鼠,给予双侧腓肠肌一次性注射sc AAV9-h IGF1病毒载体,10ul/肌,即1×1010vg/肌。三周后,麻醉处死动物,迅速取脊髓腰膨大组织,用ELISA技术检测h IGF1蛋白在小鼠腓肠肌和对应腰髓的相对表达量。结果:1一次性双侧腓肠肌注射AAV9-GFP,10μl/肌,三周后,冰冻切片,荧光显微镜下直接观察,可见腓肠肌组织、神经轴突和运动神经元都有绿色荧光蛋白(GFP)的表达;2 AAV9-GFP小鼠与空白对照组小鼠的发病时间和生存期无明显差异,两组发病时间中位数分别为96d、97d;生存期中位数均为120d,说明AAV9-GFP干预不影响小鼠的发病时间和生存期,整个实验过程未发现AAV9对小鼠有明显不良反应。终末期小鼠麻醉后取腰髓组织,运用蛋白印迹方法检测GFP蛋白的表达,发现终末期仍有GFP蛋白的表达,说明AAV9能够使基因在体内持续表达蛋白;3免疫荧光显示sc AAV9-h IGF1能逆轴突靶向转染ALS成年小鼠的腰髓运动神经元,并表达h IGF1蛋白;4 ELISA检测h IGF1蛋白在注射的腓肠肌及对应腰段脊髓的表达量,腰段脊髓h IGF1蛋白表达量为注射肌肉的35%,转染效率约为26%。第二部分肌肉注射sc AAV9-h IGF1干预ALS小鼠模型的疗效观察目的:我们用60d龄和90d龄的同窝拷贝数相同的肌萎缩侧索硬化SOD1G93A转基因小鼠为动物模型,随机分为sc AAV9-h IGF1干预组和AAV9-GFP对照组,给予一次性多部位肌肉注射,给药剂量为每块肌肉1×1010vg(10μl),观察sc AAV9-h IGF1是否对运动功能有改善作用,是否对肌肉组织、腰髓运动神经元有保护作用,能否减少星形胶质细胞和小胶质细胞的增生,最重要的是否能够推迟小鼠发病及延长生存期。方法:1动物分组:60天和90天龄的同窝SOD1G93A转基因ALS小鼠,随机一次性肌肉注射sc AAV9-h IGF1和AAV9-GFP,60天和90天龄小鼠雌雄各15对。2肌肉注射部位包括双侧的咬肌、肱二头肌、肱三头肌、肋间肌、腹肌、股二头肌、股四头肌、腓肠肌,sc AAV9-h IGF1和AAV9-GFP的用药量为10ul/肌。3每周观察并记录小鼠的评分,运动功能(转轮时间),体重等变化,每天观察并记录小鼠的发病及终末时间。小鼠的发病时间定为当天三次转轮时间(恒速15转/分)最长时间不能达到180s,记为发病;小鼠终末时间为背卧位30s不能自行翻身。ALS小鼠110d龄时记录小鼠的步长和足迹。4两组ALS小鼠110d龄时,麻醉后迅速取腓肠肌组织,冰冻切片,用HE,NADH,MGT等染色方法观察ALS小鼠腓肠肌组织的病理变化。5两组ALS小鼠110d龄时,麻醉后灌注取材,取腰髓组织,震荡切片用SMI32,GFAP,Iba1免疫组化染色观察小鼠腰髓运动神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞数量的变化。结果:1 Sc AAV9-h IGF1干预组小鼠肌肉萎缩明显减轻,后肢的外展较有力,步长较AAV-GFP组小鼠明显改善;2 Sc AAV9-h IGF1干预小鼠(60天龄给药)发病时间中位数雄雌分别延长了24天(121d vs.97d),18天(118d vs.100d);生存期中位数雌雄分别延长了29天(149d vs.120d),24天(147d vs.123d)。Sc AAV9-h IGF1干预小鼠(90天龄给药)生存期中位数雌雄分别延长了15天(138d vs.123d),14天(137d vs.123d);3无论是60天龄还是90天龄sc AAV9-h IGF1干预的ALS小鼠在神经功能评分,体重,运动功能方面都比AAV9-GFP对照组小鼠有明显改善;4肌肉病理提示AAV9-GFP对照组小鼠的肌纤维可见明显的萎缩(HE染色),呈神经源性损伤(NADH染色),线粒体损伤较重(MGT染色);Sc AAV9-h IGF1治疗组小鼠肌肉萎缩改善,也有神经源性损伤的表现,线粒体损伤较轻;5免疫组织化学显示sc AAV9-h IGF1干预小鼠与AAV9-GFP对照组小鼠相比,腰髓前角运动神经元(SMI32阳性)数量减少明显改善(P<0.05);星形胶质细胞(GFAP阳性)和小胶质细胞(Iba1阳性)的免疫组织化学结果显示sc AAV9-h IGF1能明显减轻转基因小鼠腰髓星形胶质细胞和小胶质细胞增生的程度(P<0.05)。第三部分Sc AAV9-h IGF1对ALS小鼠模型保护机制研究目的:IGF1作为神经生长因子中的一员,对中枢及外周神经系统都具有保护作用,大量实验表明IGF1能够促进运动神经元存活,并证实在临床实验中有很高的安全性。很多实验,包括我们前部分的实验,都证实了IGF1能够延缓SOD1G93A ALS小鼠模型疾病的进展,改善运动功能和延迟肌肉萎缩,减轻胶质细胞反应,保护运动神经元,延长生存期。那么IGF1是通过什么机制对SOD1G93AALS小鼠模型起作用的呢?目前尚没有一致的答案。据报道,IGF1能够通过抑制凋亡保护运动神经元和减少神经胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)。另有实验表明鞘内注射IGF1能激活PI3K/Akt和ERK信号通路,促进运动神经元的存活,我们本部分实验的目的是进一步研究IGF1对SOD1G93AALS小鼠模型的保护机制,为IGF1能够真正用于患者提供可靠实验依据。方法:1同窝拷贝数相同的80天SOD1G93A雄性小鼠随机分为sc AAV9-h IGF1干预组和AAV9-GFP对照组,肌肉注射部位包括;双侧咬肌、肱二头肌、肱三头肌、肋间肌、腹肌、股二头肌、股四头肌、腓肠肌;10ul/肌,干预14d后麻醉,新鲜取材,迅速提取腰髓RNA,利用基因芯片筛选有统计学差异的基因。2 90天和60天龄同窝拷贝数相同的SOD1G93A ALS小鼠随机分为sc AAV9-h IGF1干预组和AAV9-GFP对照组,肌肉注射双侧的咬肌、肱二头肌、肱三头肌、肋间肌、腹肌、股二头肌、股四头肌、腓肠肌,10ul/肌。干预后110天取材,利用实时定量PCR验证选出的基因,用蛋白印迹和免疫荧光定量和定位蛋白的表达。3运用免疫荧光及蛋白印迹方法证实IGF1的抗凋亡机制,凋亡指标包括TUNEL,cleaved-caspase 3和9,Bax及Bcl-2。4利用CRISPR-Cas9技术,30天龄鞘内注射干预,靶向敲除中枢神经系统运动神经元的IGF1基因,90天龄取材,利用实时定量PCR,蛋白印迹及免疫组化、免疫荧光等技术进一步验证选出的基因。结果:1基因芯片筛选结果发现sc AAV9-h IGF1干预小鼠腰髓的DAO基因水平明显高于AAV9-GFP对照组(P<0.05);2实时定量PCR验证sc AAV9-h IGF1干预小鼠腰髓的DAO基因水平明显高于AAV9-GFP对照组(P<0.05)。免疫荧光和蛋白印迹检查显示DAO主要定位于运动神经元,sc AAV9-h IGF1治疗组小鼠腰髓的DAO蛋白水平明显高于AAV9-GFP对照组(P<0.05);3 Sc AAV9-h IGF1治疗组小鼠腰髓TUNEL,cleaved-caspase 3和9,Bax等促凋亡指标下调,抗凋亡Bcl-2上调;4利用CRISPR-Cas9系统,靶向敲降中枢神经系统的IGF1基因,小鼠的症状明显加重,DAO蛋白水平出现明显下调,D-serine水平随之上升,同时cleaved-caspase 3和9促凋亡指标上调。结论:1 Sc AAV9能够携带目的基因通过肌肉注射靶向转染成年SOD1G93AALS小鼠的运动神经元。2 IGF1对SOD1G93A ALS小鼠的运动神经元和肌纤维有保护作用,能够推迟小鼠的发病时间和延长生存期。3 IGF1对SOD1G93A ALS小鼠的保护机制是通过上调DAO,降解D-serine,减轻兴奋性中毒,抑制凋亡,保护运动神经元。