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背景和目的 砷剂是一种自然物质，作为药物在中西医医学上应用已有2400多年历史，由于治疗剂量所产生的难以接受的副作用以至到20世纪中叶就不再作为治疗药物应用。自20世纪90年代开始，我国医生开始使用三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)，结果显示三氧化二砷对APL病人有效，能使APL病人PML-RAR融合蛋白降解和诱导肿瘤细胞凋亡，且没有显著骨髓抑制作用。进一步研究证明三氧化二砷不仅能在白血病病人中安全使用，也能在其它恶性肿瘤病人中应用。最近研究显示，三氧化二砷是各种肿瘤的有效治疗药物。体内、外研究证实三氧化二砷主要通过抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤内血管生成，诱导肿瘤细胞分化和凋亡等途径发挥其抗癌作用。砷剂作为治疗实体瘤的一种新抗癌药物，前景令人鼓舞，但对人鼻咽癌的治疗研究不多。本研究通过体外亚砷酸对人鼻咽癌CNE1细胞系的增殖抑制，凋亡诱导及其相关蛋白表达的影响，探索亚砷酸发挥抗鼻咽癌细胞作用及诱导凋亡的可能机制。 方法 体外抗增殖研究： 1 MTT法体外人鼻咽高分化鳞癌CNEI细胞系培养于含不同浓度 的亚砷酸、顺铂、5一氟脉嚓咙，空白培养基作为对照;应用研T 法检测24h、48h、72h和96h细胞的生长抑制率。 2倒置显微镜观察细胞生长状态。 3HE染色观察细胞形态。 4流式细胞仪(FCM)分析细胞周期改变。 5细胞增殖标志检测免疫组织化学染色方法检测反映肿瘤细胞 增殖活性的增殖细胞核抗原(PCNA)及人端粒酶催化亚基(hTRT) 蛋白表达。诱导凋亡研究: l形态学采用HE染色、Hoechst 33342/PI双染色在荧光显微镜 下观察细胞、透射电子显微镜观察亚砷酸作用下人鼻咽癌CNEI 细胞系凋亡形态改变。 2流式细胞仪(F以)检测凋亡的“亚二倍体”峰。 3TIJNEL法原位观察凋亡细胞。 4免疫组织化学染色法(工HC)检测亚砷酸诱导CNEI细胞凋亡相关 蛋白Bax、Bel一2、p53的表达。结果抗增殖作用: 1 MTT法体外实验显示亚砷酸能显著抑制CNEI细胞系的增殖， 且有时间及浓度依赖性，随着剂量增加和作用时间的延长，亚 砷酸抑制CNEI细胞增殖能力增强;相同质量浓度的亚砷酸体 外抑瘤能力优于顺铂及5一氟脉嚓咙。亚砷酸的Ic5。值在24h、 48h、72h和96h分别为3.12 pg/mL、0.65 pg/InL、0.12p g/毗和0.08 pg/mL。 2倒置显徽镜观察亚砷酸作用组细胞体积缩小、折光性变弱，2003年5月林英城:亚砷酸体外抗人鼻咽癌细胞作用的实验研究(硕士毕业论文丫 贴壁细胞减少，脱落细胞增多。且随着亚砷酸浓度的增加和作 用时间的延长更为明显。对照组细胞贴壁生长、镶嵌状排列铺 满瓶壁。 3HE染色未加药对照组，细胞呈圆形、椭圆形，核浆比例大， 可见核分裂相;亚砷酸作用组可见凋亡细胞。 4 FCM随着亚砷酸浓度的增加和作用时间的延长，其GZ/M比例 逐渐增高。 5 PCNA及hTRT免疫组织化学染色可见PCNA及hTRT阳性细胞 平均灰度值随着亚砷酸浓度的增加而逐渐减少。凋亡诱导作用: 1 CNEI细胞形态改变 (l)HE染色凋亡细胞分散存在，细胞体积变小，核固缩， 胞质深红染，核仁消失;可见核碎裂及凋亡小体形成。 (2)Hoeehst33342/Pl双染色荧光显微镜观察凋亡细胞 核变小、固缩、浅蓝色、染色质致密粗块状，核碎裂;. 少量坏死细胞染成红色。 (3)透射电子显微镜观察可见细胞核固缩，电子密度增 大，染色质呈块状凝聚于核膜下，核仁消失等细胞凋 亡的改变。部分细胞核溶解呈空泡状，细胞器结构不 清，胞膜破裂等细胞坏死的改变。 2 FCMPI染色FCM检测到“亚二倍体”峰，呈浓度、时间依 赖关系。 3 TIJNEL法TUNEL阳性凋亡细胞呈棕黄色颗粒位于细胞核。 4凋亡与药物剂量、作用时间的关系随着亚砷酸作用时间的 延长，凋亡指数增加;在亚砷酸浓度分别为0 pg/毗、0.sp g/InL、1.0 pg/mL、2.0 pg/InL、4.0 pg/InL组，作用6h的Al 分别为:0.69士0.24、0.86士0.96、0.77士0.19、0.86士0.86、 0.43士0.30;作用12h的Al分别为:0.34士0.36、1.12士0.84、2003年5月林英城:亚砷酸体外抗人鼻咽癌细胞作用的实验研究(硕士毕业论文) 0.69士0.89、0.69士0.65、3.35士1.14;作用24h的Al分别 为:0 .34士0.36、1.20士0.77、0.81士0.64、1.46士1.76、 0.95士0.98;作用48h的Al分别为:0.43士0.43、2.66士0.64、 8.15士0.96、11.59士0.68、12.10士2.24;作用72h的Al分 别为:0.94士0.96、8.15士1.36、5.06士0. 77、5.75士1.24、 9.36士1.23。不同时间组间之差别有高度显著性意义 (只0.01);剂量组间之差别也有高度显著性意义(只0.01)。 但亚砷酸浓度在0.5一4 pg/毗之间AI没有差异(乃0.05)。SB。1一2、Bax和p53蛋白表达免疫组织化学染?