伴随着中国社会经济的发展,糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)患病率也随之攀升,我国糖尿病患病率约9.7%,20～30%发展为糖尿病肾病(Diabetic Kidney Disease,DKD),并最终成为终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)的主要原因。糖尿病肾病的发生发展与多种因素有关,大的方面可以概括为先天遗传因素和生活习惯共同作用的结果,其病理机制有氧化应激,胰岛素分泌不足,机体组织细胞对胰岛素作用的敏感性减低、微炎症等,其肾脏病理改变有肾小球滤过膜破坏、肾小球硬化和肾小管上皮细胞空泡样变,间质纤维化等。肾间质纤维化的重要发生机制之一为肾小管上皮-间质细胞转分化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),对EMT相关机制如信号转导通路的研究已成为近年来DKD研究领域的热点。RhoA/ROCK信号通路参与肾小管上皮细胞转分化过程,TGF-β1分子具有非常强的致纤维化作用,能通过介导一系列信号转导通路参与DKD系膜细胞增生、增加细胞外基质的产生、肾小管上皮-间质转分化和足细胞凋亡等病理过程,加重DKD肾脏的病变过程。当TGF-β1作用于RhoA,可激活RhoA进一步作用于其下游的底物Rho激酶(ROCK),人体内广泛表达的ROCK包括有两种亚型:包括ROCK1分子和ROCK2分子,其在机体内的分布范围不同,在肾脏以ROCK1分子为主,被激活的Rho将生物信号传递给ROCK1分子,使其分子中的第854位丝氨酸和第697位苏氨酸发生磷酸化而发生激活,引起EMT的发生。在EMT过程中,Rho的激活是一个关键性的步骤,高糖或TGF-β1可以激活Rho/ROCK信号通路,在TGF-β1诱导的α-SMA表达的EMT过程中,Rho起核心作用。RhoA/ROCK通路对细胞间的黏附与细胞迁徙、增殖与凋亡、靶基因的转录、细胞增殖周期的调节、上皮-间质转分化与肌动蛋白细胞骨架的重新排布等有关。在中医对DKD认识的基础上,导师提出"肾痿"科学假说,DKD病情迁延则热、郁、痰湿、瘀血、毒邪相互胶结于肾脏,阻滞气血运行,使肾脏的结构破坏,"肾体"受损,肾脏的结构破坏必然最终导致肾脏正常功能受损甚至丧失,即"肾用"失常,"肾体"和"肾用"均受到损害,长此以往,肾脏痿废不用,终至"肾痿","肾痿" 一词,不仅归纳了其病机,也阐释了疾病的最终状况。本课题组围绕"肾痿"假说,在体内整体动物实验方面,选取SD大鼠、Wistar大鼠和KKAy小鼠3个品种动物,采用STZ诱导和基因易感配合高脂饲料诱导2种造模手段,对糖肾平和糖肾宁对DKD的作用机制进行研究;在体外细胞实验方面,选用大鼠肾小球足细胞和小鼠肾小管上皮细胞2个品种的实验细胞,采用高糖+LPS刺激足细胞和高糖刺激肾小管上皮细胞2种刺激手段,再次对糖肾平和糖肾宁对DKD的作用机制进行研究。研究内容方面,本课题组重点从下调糖尿病肾病肾组织中单核细胞趋化因子-1(MCP-1),减少细胞外基质(ECM)在肾小球系膜区以及肾小管间质的沉积、抑制足细胞凋亡、逆转足细胞转分化和抑制肾小管上皮细胞转分化等五大方向,从整体动物实验和体外细胞培养两个方面对"肾痿"假说的科学内涵进行了研究。本研究采用DKD KKAy小鼠和小鼠肾小管上皮细胞为研究对象,以DKD肾小管上皮-间质转分化为切入点,采用免疫组化、原位杂交和Western blotting方法,从动物实验和体外细胞实验两个角度进一步探讨糖肾平对DKD肾脏的保护作用和对EMT相关RhoA/ROCK1信号通路关键分子表达的影响,为"肾痿"假说提供实验依据。目的:动物实验采用DKD KKAy小鼠,研究糖肾平对DKD KKAy小鼠的药效学和体内氧化应激的影响,运用免疫组化和原位杂交观察糖肾平对肾组织中TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin蛋白及mRNA表达的影响;细胞实验采用小鼠肾小管上皮细胞,通过MTT实验研究糖肾平对肾小管上皮细胞增殖水平的影响,应用Western blotting研究其对肾小管上皮细胞RhoA、ROCK1、α-SMA、E-CAD蛋白表达的影响。方法:1.糖肾平对DKD KKAy小鼠药效学的影响正常组为10只健康,雌性,SPF级,黑色小鼠(C57BL/6J),60只雌性10周龄KKAy小鼠用KK鼠配合饲料诱导10周后,检测发现血糖≥16.7mmol/L24h,尿蛋白≥0.4mg,据此可以判断糖尿病肾病动物模型制作成功。造模成功的KKAy小鼠根据血糖和体重,以分层随机方式分为模型组,厄贝沙坦组,糖肾平小、中、大剂量组,灌胃给药。记录小鼠一般情况,记录体质量计算所有实验动物24h尿蛋白定量。所有小鼠于第26周摘眼球取血,测血糖、甘油三酯(Triglyeride,TG)、肌酐(Serum creatinine,Scr)和尿素氮(Bloodureanitrogen,BUN);用电子天平对无菌取材后的小鼠肾脏称重,记录后计算肾重/体重比;小鼠肾石蜡包埋并切片,做HE、Mallory和PAS染色,分析小鼠肾脏的病理学形态变化。2.全自动生化仪检测小鼠血清丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量。3.免疫组织化学:检测小鼠肾组织石蜡切片中TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cad蛋白的表达水平。4.原位杂交组织化学:检测小鼠肾组织石蜡切片中TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cad mRNA的表达水平。5.Western blotting蛋白印迹技术:检测体外培养的小鼠肾小管上皮细胞中RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cad蛋白的表达水平。6.所有的实验数据用SPSS 22.0统计软件进行分析。结果:1.糖肾平对DKDKKAy小鼠药效学的影响与模型组相比,糖肾平小、中、大剂量组的小鼠一般状态得到改善,同时体质量均有不同程度降低,治疗16周后,糖肾平大剂量组小鼠体质量明显减轻(P<0.01),肾质量与体质量比值明显降低(P<0.01),24h尿蛋白定量明显减少(P<0.01),血清BUN含量明显降低(P<0.01),TG、Scr含量降低(P<0.05),糖肾平中剂量组和大规量组肾小球、肾小管基膜仅轻度增厚,肾脏病理改变明显减轻。2.糖肾平对DKD KKAy小鼠氧化应激的影响与模型组相比,糖肾平小、中、大剂量组血清中的NO、SOD含量显著升高(P<0.01),同时MDA含量显著降低(P<0.01)。3.糖肾平对DKDKKAy 小鼠肾组织 TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin蛋白表达的影响免疫组织化学表明:正常对照组的肾小管上皮细胞有少量TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA蛋白表达,明显低于模型组(P<0.01);与模型组相比,除糖肾平小剂量组外,各治疗组肾小管上皮细胞TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA蛋白表达均明显降低(P<0.01);且糖肾平各组中以中剂量和大剂量组降低最明显,中、大剂量组之间无统计学差异。正常对照组肾小管上皮细胞胞质内E-Cadherin蛋白表达量多,明显高于模型组的表达量(P<0.01);与模型组比较,除糖肾平小剂量组外,各治疗组的肾小管上皮细胞胞质内E-Cadherin蛋白表达明显增多(P<0.01),且糖肾平各组中以中剂量组和大剂量组降低最明显,中、大剂量组之间无统计学差异。4.糖肾平对 DKDKKAy 小鼠肾组织 TGF-β1 RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin mRNA表达的影响原位杂交显示:正常对照组肾小管上皮细胞有少量TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA mRNA表达,明显低于模型组(P<0.01);与模型组比较,除糖肾平小剂量组外,各治疗组肾小管上皮细胞TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMAmRNA表达明显降低(P<0.01),糖肾平各组中以中、大剂量组降低最明显。正常对照组肾小管上皮细胞胞质有大量E-CadherinmRNA表达,明显高于模型组(P<0.01);与模型组比较,除糖肾平小剂量组外,各治疗组肾小管上皮细胞胞浆E-CadherinmRNA表达均明显升高(P<0.01),糖肾平各组中以中、大剂量组肾小管上皮细胞胞浆E-CadherinmRNA表达明显升高最明显,有显著统计学差异(P<0.01)。5.糖肾平对体外高糖刺激肾小管上皮细胞TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin蛋白表达的影响Western blotting 显示:正常对照组少量表达 TGF-β1、RhoA、ROCK1 和 α-SMA,显著低于高糖组(P<0.01);与高糖组相比,糖肾平中剂量组和大剂量组肾小管上皮细胞TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。正常对照组E-Cadherin表达水平明显高于高糖组(P<0.01);与高糖组相比,糖肾平中剂量组和大剂量组E-Cadherin蛋白表达增加,有显著统计学差异(P<0.01)。结论:1.糖肾平可以改善DKDKKAy小鼠的一般状态,减轻其体质量和肾重体重比,减少24h尿蛋白定量,减轻其肾脏的病理损伤,并且其疗效与剂量有关。2.糖肾平可以降低实验动物血清MDA水平,升高NO、SOD水平,改善DKD KKAy小鼠体内的氧化应激状态,从而保护肾脏功能。3.糖肾平可以减少肾组织内TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA蛋白及mRNA的表达,增加E-Cadherin蛋白及mRNA的表达,从而抑制肾小管上皮细胞转分化。4.糖肾平可以减少体外高糖刺激的肾小管上皮细胞内RhoA、ROCK1、α-SMA蛋白的表达,增加E-Cadherin蛋白的表达,从而抑制肾小管上皮细胞EMT。糖肾平能改善DKD KKAy小鼠的一般状态,其肾脏保护及抑制肾小管上皮细胞EMT的作用,可能和降低氧化应激水平及调节肾小管上皮细胞中RhoA/ROCK信号通路有关,这为DKD "肾痿"科学假说提供了新的实验依据。