研究背景战创伤等高能量损伤常造成严重开放性骨折并易继发感染。早期清创是治疗的关键,也是后续其他治疗的基础。目前临床最常见清创技术即锐性手术切除结合盐水冲洗或者碘伏消毒液和双氧水冲洗,沿用多年。对于伤后细菌沾染效果较好,但对于细菌已经定植并已经形成感染的情况,在能否有效减少组织中的细菌载荷方面,效果值得怀疑。近年来创面的清创的有了一些新的器械和方法,如高压脉冲冲洗、低压脉冲冲洗、以及Versajet水刀系统等等。而脉冲冲洗对于组织的损伤也是不可忽视的,Versajet水刀系统更适用于创面的清创,目前对于清创术中是否需应用低毒性的消毒剂尚有争议。低频超声波作为一种独特的能量释放方式(空化效应)也已经用在各种急性创伤和慢性感染创面的治疗中,其清除作用的机理以及能否直接杀菌目前还不十分清除。需要进行研究验证。研究目的1、明确低频超声与聚己双胍(PHMB)在清除和杀灭体外浮游态和生物膜态金葡菌单独和协同效应;2、设计建立全新可靠的胫骨局限性骨感染兔动物模型;3、检验超声清创联合PHMB对金葡菌接种后48小时兔骨感染模型的治疗效果。研究方法实验1.(1)将金黄色葡萄球菌接种于LB培养基中,形成含有浮游菌的菌液,给与不同时间梯度(0秒?5秒?10秒?20秒?30秒?60秒?120秒?300秒?600秒)的低频超声暴露后,行细菌涂板计数和液体培养混浊度定性观察评估。(2)向含有金黄色葡萄球菌的LB培养基中加入由20%PHMB溶液经不同比例稀释的PHMB溶液(1:100、1:200、1:500、1:100、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:20000、PBS液),作用1小时后,行细菌的定量检测。(3)将LB培养基中的浮游态金黄色葡萄球菌接受30秒低频超声作用,再与由20%PHMB溶液经不同比例稀释的溶液(1:100、1:200、1:500、1:100、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:20000、PBS液)作用,检测不同浓度梯度下的细菌剩余量和定性评估。(4)在接种有金葡菌的培养孔板底部通过隔日换液培养形成金葡菌生物膜。然后使其接受由20%phmb溶液经不同比例稀释的phmb溶液(空白对照、1:5000、1:2000、1:1000、1:500、1:200、1:100、1:10)处理。再对各处理组进行细菌定量测定。(5)在接种有金葡菌的培养孔板底部通过隔日换液培养形成金葡菌生物膜。细菌生物膜接受30秒超声辐照与由20%phmb溶液经不同比例稀释的phmb溶液(空白对照、1:5000、1:2000、1:1000、1:500、1:200、1:100、1:10)作用后进行细菌计数。(6)在接种有金葡菌的培养孔板底部通过隔日换液培养形成金葡菌生物膜。将孔分成4组,每组9个。分别行pbs液冲洗,30秒超声作用,0.05%phmb作用以及30秒超声联合0.05%phmb作用后,行结晶紫染色。测定结晶紫染色后数码照片的灰度值,并在各组之间进行比较。实验2(1)配制金葡菌接种菌液。采用麦氏比浊法制备log10(cfu/ml)为8的细菌生理盐水悬液作为浮游菌接种液。(2)将兔骨块置入含有金葡菌的lb培养基中培养48小时形成载菌骨。涂板法测定每块载菌骨含菌量为log10(cfu/块)为6.9±0.5。(3)实验动物分成2组,每组10只,a组以菌液接种,b组以载菌骨接种,观察两种动物模型的感染成功率,病死率,体温和crp反应特点,局部创口愈合情况,以及x片的表现和病理切片检查。实验3(1)将兔骨块置入含有金葡菌的lb培养基中培养48小时形成载菌骨。(2)50只雄性新西兰白兔,完全随机法分成5组。所有动物于右胫骨近端钻孔接种载菌骨,术后48小时后按分组进行清创。(3)nacl组行清创后生理盐水冲洗;us组,清创后采用低频超声波结合生理盐水冲洗;phmb组为清创后性0.1%phmb溶液轻柔冲洗,us+phmb组为清创后采用低频超声波结合0.1%phmb联合冲洗。碘伏组为清创后应用0.1%稀释碘伏溶液冲洗。(4)观察指标为术后动物的体温、体重、术后6周时局部创口外观评分,x线评分,以及病理评分进行组间比较。结果实验1(1)浮游态细菌在不同低频超声暴露时间后,细菌计数变化不显著。(2)对于浮游态细菌由20%phmb经不同倍数稀释的溶液作用,细菌的减少量呈现出明显的浓度依赖性,于1/200稀释组(浓度为0.1%),实现了全部杀菌。(3)对于浮游表型的金葡菌,不同稀释倍数的PHMB结合超声杀菌后的定量检测发现,杀菌效能仍然随着浓度的升高而增强,但是仅在20%PHMB溶液稀释2000倍(浓度为0.01%)时就可以将细菌全部杀灭。(4)孔板对于0.04%PHMB与超声处理单独处理后,结晶紫染色后灰度值都有升高,联合处理后更明显。经方差分析,0.04%PHMB与超声处理之间存在协同效应。实验2(1)涂板法测定每块载菌骨含菌量为log10(CFU/块)为6.9±0.5。(2)A组动物,术后体温波动较B组动物更大,而且有3只死亡,而B组动物在4周观察时间内都有存活。AB两组动物体重变化不大。A组动物中成功形成骨髓炎5只,B组成功形成骨髓炎10只。A组X线表现为髓内型,而B组X线表现为局部型。A组动物CRP检测波动大于B组动物。两组动物病理学检查都成典型骨髓炎表现。细菌培养A组存活动物7只中2只阴性,5只阳性。B组存活动物10只,均阳性。实验3所有接种载菌骨动物术后48小时均存活,局部出现红肿渗出。NaCl组、PHMB组、PHMB+US组、碘伏组、动物均有1只在第6周实验终点前死亡,而US组有2只死亡。各组动物术后体温变化、体重变化差异没有统计学意义。PHMB+US组在局部创面评分、X片表现视觉评分以及病理评分,都优于其他各组,而其他各组之间差异不显著。结论1、低频超声本身对于体外金黄色葡萄球菌的几乎没有杀菌作用。2、PHMB可杀灭体外浮游态与生物膜态金葡菌。药物浓度越高,杀菌效果越好。生物膜态金葡菌对于PHMB具有更强耐药性。3、无论对于浮游态细菌还是生物膜态细菌,PHMB与低频超声在杀灭细菌作用上都存在协同,但生物膜态细菌仍然难以完全杀灭。4、采用载菌骨植入法可建立兔局限性骨髓炎模型。该模型具有建模成功率高,全身反应轻,死亡率低的优点。可以模拟人类外伤所致的局部局限性骨髓炎。5、单独应用超声对于早期局限骨感染清创并不能有效控制感染,而超声联合PHMB有利于早期局限性骨感染的控制。