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背景:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),是一种主要发生于大肠黏膜及黏膜下层的非特异性炎症性肠病,病程长,易复发。主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等,还会出现里急后重、肠穿孔、息肉等其他症状,甚至出现癌变,发生率逐年提高。虽然目前UC的发病机制尚不明确,但人们逐渐认识到了肠道菌群对UC的影响作用。肠道菌群对人体的免疫、消化和代谢起着重要作用,而结肠是人体肠道内菌群种类和密度最多的部位。目前治疗药物集中在SASP、糖皮质激素类和免疫抑制剂类,使用较为局限,且易出现不良反应。艾灸作为中医传统的绿色疗法,可温通经脉,调气行血、温阳止泻、补脾益肾,培补元气,达到强身健体、增强免疫的目的。以往研究常选取关元、足三里等远端穴位,取培本固原之意。但相比之下神阙穴在解剖位置以及穴性、主治上都与胃肠道联系更为密切。神阙穴紧邻肠道,有丰富的血管和淋巴组织,具有回阳救逆、健运脾胃、分清泌浊、调节阴阳的疗效,据记载,神阙穴对泄痢有独到之功。虽有学者在此方向有所研究,但检测方法普遍传统,结果较为局限,所以本次实验以温和灸神阙穴为干预方法,通过16S rDNA高通量测序探究其对UC模型小鼠肠道菌群机制的影响作用。目的:探究艾灸神阙穴对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群结构的影响。本实验选用SPF级ICR小鼠为研究对象,采用葡聚糖硫酸钠(DSS)自饮法诱导溃疡性结肠炎小鼠模型,观察艾灸神阙穴对溃疡性结肠炎模型小鼠疾病活动指数评分、结肠长度、结肠组织结构和血清中促炎性因子IL-6和TNF-α的影响,以评价艾灸神阙穴对UC小鼠症状的缓解效果。基于16S rDNA高通量测序技术,通过对物种注释与评估观察小鼠菌群内微生物多样性信息,通过α多样性分析及PCoA分析判断组间菌群结构差异,再通过物种组成成分分析,在不同分类水平分析不同组间的具体菌种差异,以探究艾灸神阙穴对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响。同时与UC治疗常用药物美沙拉嗪作对照,为后期研究和临床的应用提供借鉴。方法:以32只SPF级健康雄性ICR小鼠(20-23)g为研究对象,随机选取8只作为空白组,其余通过3.5%DSS自饮法进行造模,持续8d。造模成功后再随机分为模型组、艾灸组和美沙拉嗪组,各组分别采取以下方式干预8 d:艾灸组小鼠每日抓取后用固定器固定,对神阙穴行温和灸法,20min/d;空白组、模型组同艾灸组,每日进行抓取固定;美沙拉嗪组小鼠灌服美沙拉嗪溶液,按体质量给药,给药量为0.4 g/kg。干预结束后,通过疾病活动指数评分(DAI)、结肠长度、HE染色病理组织切片及ELISA法测定促炎性因子的水平来观察UC小鼠的恢复情况,再通过16S rDNA高通量测序技术对小鼠粪便分析肠道菌群情况。结果:1.与空白组相比,模型组小鼠出现体重减轻、便血、稀便等症状,DAI评分明显升高(P<0.05),结肠长度缩短(P<0.05),结肠组织切片呈现大量炎性细胞浸润的病理状态,血清中促炎性因子IL-6与TNF-α含量明显升高(P<0.05);经过干预治疗后,与模型组相比,艾灸组和美沙拉嗪组症状减轻,DAI评分均明显下降(P<0.05),结肠长度增加(P<0.05),结肠组织切片显示病理状态有所恢复,血清中促炎性因子IL-6与TNF-α含量明显降低(P<0.05);与美沙拉嗪组相比,艾灸组在DAI评分、结肠长度和IL-6与TNF-α含量上均无明显差异。2.物种注释与评估结果显示,本次测序样本量、数据量已达到足够大,数量合理,可反映绝大比例的微生物多样性信息;与空白组相比,模型OTU数目下降,艾灸组、美沙拉嗪组OTU数目上升,与空白组相近;α多样性分析显示,与空白组相比,模型组Sobs指数、Shannon指数显著下降(P<0.01);与模型组相比,艾灸组和美沙拉嗪组均显著提升(P<0.01);艾灸组、美沙拉嗪组与空白组Shannon指数比较无明显差异。PCoA分析显示R值为0.5831,P<0.01,表明各组之间菌群组成有明显差异;模型组与空白组边界清晰,分布离散,提示模型组小鼠的菌群结构发生了改变,而艾灸组、美沙拉嗪组与空白组距离较近,提示艾灸和美沙拉嗪均对菌群结构组成有所影响,并朝着空白组趋势改变。3.物种组成成分分析结果显示,在门水平上,与空白组相比,模型组拟杆菌门(Bacteroidetes)比例上升,厚壁菌门比例(Firmicutes)下降,F/B值降低,且变形杆菌门明显增多;与模型组相比,艾灸组与美沙拉嗪组拟杆菌门比例下降,厚壁菌门比例上升,F/B值升高,变形杆菌门比例下降;在属水平上,与空白组相比,模型组小鼠毛螺菌科NK4A136组(Lachnospiraceae NK4A136 group)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、毛螺菌科未分类菌属(unclassified of Lachnospiraceae)、瘤胃梭菌属 9(Ruminiclostridium 9)、Odoribacter属显著降低(P<0.05 或 P<0.01),norankof Muribaculaceae、乳酸杆菌属(Lactobacillus)降低;拟杆菌属(Bacteroides)、副萨特氏菌属(Parasutterella)、肠球菌(Enterococcus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)显著升高(P<0.05或P<0.01),布劳特菌属(Blautia)升高。与模型组相比,艾灸组和美沙拉嗪组均可以降低拟杆菌属(Bacteroides)、副萨特氏菌属(Parasutterella)、肠球菌(Enterococcus)、克雷伯氏菌(Klebsiella),升高毛螺菌科 NK4A136 组(Lachnospiraceae NK4A136 group)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、毛螺菌科未分类菌属(unclassified of Lachnospiraceae)、瘤胃梭菌属 9(Ruminiclostridium 9)、Odoribacter 属、norank of Muribaculaceae、乳酸杆菌属(Lactobacillus)。与模型组相比,艾灸组在拟杆菌属(Bacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、毛螺菌科 NK4A136 组(Lachnospiraceae NK4A136 group)、毛螺菌科未分类菌属(unclassified of Lachnospiraceae)有明显差异(P<0.05或P<0.01),美沙拉嗪组在拟杆菌属(Bacteroides)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、毛螺菌科 NK4A136 组(Lachnospiraceae NK4A136 group)、毛螺菌科未分类菌属(unclassified of Lachnospiraceae)有明显差异(P<0.05或P<0.01)。LEfSe多级物种差异判别分析结果显示,空白组小鼠拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、norank of Lachnospiraceae为特征菌种;模型组小鼠以拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌属(Bacteroides)、副萨特氏菌属(Parasutterella)、肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)为特征菌种;艾灸组以真杆菌属fissicatena组和Allobaculum为特征菌种,美沙拉嗪组以毛螺菌属NK4A136组(Lachnospiraceae NK4A136 group)、Dubosiella 和芽孢八叠球菌(Sporosarcina)为特征菌种。结论:1.艾灸神阙穴可减轻UC体重下降、便血、腹泻、结肠缩短等症状,降低DAI评分,改善结肠组织炎性反应,降低促炎性因子IL-6和TNF-α的含量,促进UC小鼠恢复;艾灸对UC的治疗效果与美沙拉嗪相当;2.艾灸神阙穴可以改善UC小鼠肠道菌群结构,恢复肠道菌群多样性与丰富度,升高F/B值,抑制致病菌的生长,增加有益菌的增殖,尤其促进了一些与短链脂肪酸生成的相关菌种的生成;3.艾灸对UC小鼠产生的治疗作用的机制与调节肠道菌群失调、改善结肠炎性反应有关。