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肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统恶性肿瘤中较为常见的恶性肿瘤,其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc RCC)是肾细胞癌中最常见的肿瘤类型。全球每年约有35000例新发肾细胞癌患者,而每年因肾细胞癌而造成死亡的患者约有14000人。由于早期肾细胞癌缺乏明显的症状和体征,肾细胞癌的诊断现在仍依赖于B超、CT和MRI等影像学资料,因此一部分患者在初诊肾细胞癌时已经存在有远处转移。针对转移性肾细胞癌,化疗及放疗敏感性均较差,而免疫治疗及分子靶向治疗对转移性肾细胞癌的预后有一定的改善作用,但仍然不够理想。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类锌离子依赖的内肽酶家族,可通过破坏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)从而促进恶性肿瘤的侵袭和转移。膜型基质金属蛋白酶-2(membrane type matrix metalloproteinase-2,MT2-MMP)最初是从人肺c DNA库中分离得到,其基因全长3530 bp,编码产生由669个氨基酸组成的蛋白。作为MMPs家族中的一员,其不仅具有对ECM的蛋白水解作用,同时还可参与细胞内外信号调节,激活其它MMPs共同参与细胞周围微环境的重构。研究发现,MT2-MMP在多种恶性肿瘤如胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、食管癌及乳腺癌中均呈高表达。但目前关于MT2-MMP在肾透明细胞癌中表达及作用的研究尚十分有限,缺乏对其作用具体机制的深入研究。本研究通过检测肾透明细胞癌组织标本及肾透明细胞癌细胞系中MT2-MMP的表达水平,分析其与肾透明细胞癌肿瘤分级分期及预后的相关性,进一步研究MT2-MMP与肾癌细胞侵袭、转移及细胞增殖之间的关系,并研究其可能相关的信号通路,探讨可能的作用机制,从而为肾透明细胞癌的诊断和治疗提供新的可能的标志物和靶点。第一部分MT2-MMP在肾透明细胞癌组织中的表达及临床意义目的:研究肾透明细胞癌组织中膜型基质金属蛋白酶-2(MT2-MMP)的表达及其与肾透明细胞癌临床特征以及预后的关系。方法:首先通过Meta分析MT2-MMP在恶性肿瘤中表达情况及其与预后的关系。而后通过q RT-PCR检测于我院进行手术的13例肾透明细胞癌患者肿瘤及癌旁组织中MT2-MMP表达情况,而后通过免疫组织化学方法,检测90例肾透明细胞癌组织切片中肾癌组织及癌旁组织中MT2-MMP及CD34的表达。比较肾癌组织与癌旁组织中MT2-MMP的表达差异,并通过χ~2检验比较肾癌组织中MT2-MMP表达与肾癌分期、组织分化程度及患者年龄、性别的关系,采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验方法检验MT2-MMP表达与患者生存预后的相关性,应用单因素及多因素Cox模型分析不同肿瘤临床指标患者术后的死亡风险程度,Pearson线性相关分析MT2-MMP表达与微血管密度的相关性。结果:Meta分析表明MT2-MMP在多种在肿瘤中均呈高表达,且MT2-MMP表达情况与患者预后呈显著负相关(P<0.05)。MT2-MMP m RNA在肾癌组织中的表达高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化染色结果显示肾透明细胞癌肿瘤组织及癌旁组织中的MT2-MMP表达H-score分别为217.4±24.8及153.6±30.7,两者差异有统计学意义(P<0.05)。高MT2-MMP表达组与低MT2-MMP表达组患者其肾癌分期及组织分化程度存在差异,差异具有统计学意义(P<0.05),不同MT2-MMP表达组患者年龄、性别及肿瘤位置无显著差异(P>0.05)。MT2-MMP都对患者术后总生存时间有显著影响,Cox单因素及多因素分析表明MT2-MMP H-score≥216.0是肾癌患者术后死亡的独立危险因素(P<0.05),同时MT2-MMP表达与肿瘤微血管密度呈显著正相关(r=0.566,P<0.05)。结论:MT2-MMP在肾透明细胞癌的发生发展起到重要的作用,同时其可作为肾透明细胞癌患者预后风险预测指标,肾癌组织中MT2-MMP表达越高则其预后越差。第二部分MT2-MMP对于肾透明细胞癌生物学行为影响的研究目的:检测和比较不同肾癌细胞系中MT2-MMP的表达差异,并研究MT2-MMP对肾癌增殖侵袭的作用。方法:通过Western blot及实时定量逆转录-聚合酶链反应(q RT-PCR)方法检测人肾癌细胞系ACHN、786-O、OS-RC-2及人胚肾细胞系293T中MT2-MMP及MT1-MMP的表达水平并进行比较。构建MT2-MMP基因下调慢病毒载体并转染肾癌细胞系ACHN及786-O,采用细胞侵袭检测、CCK-8细胞增殖检测、流式细胞检测、细胞粘附试验等观察下调MT2-MMP表达水平下肿瘤细胞功能情况。同时将下调MT2-MMP表达的肾癌细胞及对照组细胞注射于裸鼠皮下,通过测量肿瘤大小及免疫组化染色观察下调MT2-MMP表达对肿瘤生长及微血管生成的影响。结果:MT2-MMP在人肾癌细胞系ACHN、786-O及OS-RC-2中的表达均显著高于其在人胚肾细胞系293T中的表达(P<0.05)。MT2-MMP与MT1-MMP在不同肾癌细胞系中表达存在差异但无显著相关性(P>0.05)。MT2-MMP表达下调的人肾癌细胞系ACHN及786-O其细胞侵袭、粘附及增殖能力受到显著地抑制(P<0.05),动物实验表明下调MT2-MMP表达能显著抑制肿瘤细胞生长及肿瘤微血管生成(P<0.05)。结论:MT2-MMP在不同肾癌细胞系中均呈高表达,且不同肾癌细胞系中表达存在差异,其在肾癌细胞中的表达与MT1-MMP无显著相关性,降低MT2-MMP表达水平可抑制肾癌细胞的增殖及侵袭转移能力。第三部分表达谱基因芯片筛选稳定转染sh MT2-MMP基因的肾癌细胞中肿瘤增殖侵袭相关差异表达基因目的:应用表达谱基因芯片技术筛选稳定转染sh MT2-MMP基因的肾癌细胞系中与肿瘤增殖侵袭相关的差异表达基因。方法:提取稳定转染Lv-sh MT2-MMP基因的肾癌细胞系(ACHN及786-O)及稳定转染Lv-NC的对照组肾癌细胞系(ACHN及786-O)总RNA,通过基因芯片技术筛选差异表达基因,并对筛选出的差异表达基因利用q RT-PCR进行验证。结果:与对照组相比,MT2-MMP表达下调的肾癌细胞系共筛选出3368个共同差异表达基因,其中共同表达上调的基因1851个,共同表达下调的基因1517个,通过基因功能分析显示,这些差异表达基因涉及到细胞增殖、分化、细胞外基质组织、细胞粘附、免疫应答、细胞周期等,并关系到多条肿瘤相关信号通路。在全部差异表达基因中进一步筛选出5条与肿瘤相关的差异明显基因,q RT-PCR验证发现各基因变化趋势与基因芯片一致。结论:MT2-MMP可能可以通过影响多种与肿瘤增殖侵袭相关的基因进而促进肾透明细胞癌的增殖和侵袭。