【摘 要】
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脓毒症是机体对感染的免疫反应失调所致的危及生命的多器官功能障碍,缺乏特异性的治疗药物,是目前世界范围内感染致死的最主要的原因。病原菌的代谢产物及结构成分会激活机体的免疫细胞,在脓毒症发生发展过程中,免疫细胞被大量募集至感染部位,过度产生的炎症介质造成炎症反应失控,进而导致机体多器官功能障碍甚至死亡。因此,控制过度的炎症反应,尤其是在早期控制巨噬细胞等炎症细胞迁移到组织器官的过程,可能对脓毒症的治疗
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脓毒症是机体对感染的免疫反应失调所致的危及生命的多器官功能障碍,缺乏特异性的治疗药物,是目前世界范围内感染致死的最主要的原因。病原菌的代谢产物及结构成分会激活机体的免疫细胞,在脓毒症发生发展过程中,免疫细胞被大量募集至感染部位,过度产生的炎症介质造成炎症反应失控,进而导致机体多器官功能障碍甚至死亡。因此,控制过度的炎症反应,尤其是在早期控制巨噬细胞等炎症细胞迁移到组织器官的过程,可能对脓毒症的治疗具有重要的意义。课题组前期的研究结果表明苦参碱衍生物MASM具有很强的抗炎和抗脓毒症的作用,既显示出预防作用,滞后给药还显示出显著的治疗作用,表现为提高动物生存率、降低炎症因子水平、减轻多个器官的炎症细胞浸润和组织损伤等。上述作用可能与MASM抑制炎症细胞迁移到组织器官有关。为了寻找MASM的作用靶点,课题组利用细胞膜色谱技术结合药物亲和反应靶蛋白稳定技术,经质谱鉴定发现核糖体蛋白67-k D层粘连蛋白受体(67-k D laminin receptor,67LR)是MASM特异性结合的细胞膜受体。MASM与已知67LR配体的竞争性结合实验以及表面等离子共振分析实验的结果同样提示67LR可能是MASM的细胞膜靶点。为了进一步阐明MASM的作用机制以及67LR在脓毒症发生发展过程中的作用,在本研究中我们考察了67LR对MASM抑制巨噬细胞迁移和抗脓毒症作用的影响。我们首先研究了MASM对巨噬细胞迁移的影响。采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,应用LPS诱导巨噬细胞迁移为模型,观察MASM对巨噬细胞迁移的影响。结果显示MASM能浓度依赖地抑制LPS诱导的巨噬细胞迁移。我们接下来采用小鼠骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)验证MASM对LPS诱导的巨噬细胞迁移的抑制作用,以及采用单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)诱导BMDM迁移为模型验证MASM的作用,结果表明MASM能浓度依赖地抑制LPS或MCP-1诱导的巨噬细胞迁移。为了研究MASM抑制巨噬细胞迁移是否通过67LR发挥作用,我们制备了Lox P转基因小鼠(Rpsaflox/flox),再将该小鼠与髓系细胞特异性表达Cre酶的转基因小鼠(Lyz2-Cre)杂交,成功制备了髓系细胞特异性67LR(Rpsa)基因敲除/减小鼠(Lyz2-Cre:Rpsaflox/flox)。Real-time RT-PCR、Western blot和流式细胞术的结果均表明Lyz2-Cre:Rpsaflox/flox小鼠BMDM中67LR(Rpsa)被敲减。利用上述基因敲减小鼠,通过体外细胞迁移实验我们发现,67LR敲减导致LPS或MCP-1诱导的BMDM迁移数量显著减少;在67LR敲减的情况下MASM不能进一步抑制BMDM细胞迁移,提示MASM通过67LR发挥抑制巨噬细胞迁移的作用。我们进一步研究了髓系细胞67LR敲减对脓毒症小鼠器官损伤的影响以及MASM是否通过67LR发挥器官保护作用。我们采用盲肠结扎穿刺法(CLP)制备小鼠脓毒症模型,首先以脓毒症主要损伤靶器官肺为研究对象,与Rpsaflox/flox模型组小鼠相比,Lyz2-Cre:Rpsaflox/flox模型组小鼠肺组织损伤减轻,巨噬细胞和中性粒细胞浸润减少,Real-time RT-PCR结果显示IL-6和i NOS m RNA水平下降,TNF-α和IL-1βm RNA水平无显著变化。MASM能减轻Rpsaflox/flox脓毒症小鼠肺组织内炎症细胞浸润,但是在髓系细胞67LR敲减的情况下不能继续发挥作用;MASM抑制TNF-α和IL-1β的作用不受67LR敲减的影响;MASM减轻Rpsaflox/flox脓毒症小鼠肺组织损伤,在髓系细胞67LR敲减的情况下仍发挥作用,但是改善组织损伤的幅度较对照组有所降低。此外,我们通过检测血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和淀粉酶等生化指标考察了肝、肾和胰的损伤程度。髓系细胞67LR敲减能减轻脓毒症小鼠肝、肾和胰损伤。MASM能显著减轻Rpsaflox/flox脓毒症小鼠肝、肾和胰损伤,在髓系细胞67LR敲减的情况下,MASM不能进一步减轻肝和胰损伤,对肾损伤仍有一定减轻作用,但是减轻损伤的幅度有所降低。综上所述,67LR下调能抑制巨噬细胞的迁移功能,髓系细胞67LR敲减能减轻脓毒症小鼠肺组织炎症细胞浸润以及肺、肝、肾和胰等多器官损伤。MASM通过67LR抑制炎症诱导的巨噬细胞迁移,部分通过67LR减轻脓毒症所致的多器官损伤。
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