背景:血管内皮细胞沿着整个循环系统,由心脏直至最小的微血管,位于心、血管内皮表面,形成血管内膜的一层扁平上皮细胞群,细胞排列紧密,是血液和血管组织间的屏障。当血管内皮在受到有害因素侵袭时,内皮细胞损伤,出现代谢、增殖、凋亡等生理功能紊乱,局部血管动态平衡失衡,继而出现细胞群分泌、抗栓、免疫等功能异常,最终发生一系列的心血管事件。在进行血管内皮细胞实验时,通常选用的细胞模型为人脐静脉内皮细胞。同型半胱氨酸（Homocystieine,Hcy）是一种含硫氨基酸,来源于蛋氨酸循环代谢,具有重要生理功能,与多种心脑血管疾病的发生、发展密切相关,且独立于传统的心血管疾病危险因素。已有的研究显示Hcy引起内皮功能障碍,包括抑制细胞增殖和周期。目前,细胞功能影响主要为细胞增殖、凋亡和周期。细胞以分裂方式进行增殖,可以补充体内衰老、损伤或凋亡的细胞,是生命体重要的生命特征。细胞凋亡包括体内自然程序性死亡和病理或环境诱导细胞死亡,是细胞自我毁灭机制。细胞周期是指从一次细胞分裂到下一次分裂的全过程,是细胞完成增殖的具体过程。同型半胱氨酸诱导的细胞功能紊乱主要形式在于对细胞增殖、凋亡和周期的影响,且任何一个环节都会导致细胞生长功能障碍。通常情况采用CCK8试剂盒体外细胞的增殖检测,具其灵敏度高,毒性小和操作简单等特点。细胞增殖主要利用细胞线粒体脱氢酶还原为反应底物,检测450nm波长处的吸光度值间接反应细胞数量。细胞凋亡原理依据细胞膜抗原位置改变及细胞通透性来反应细胞凋亡程度。细胞周期根据核酸染料的染色反应细胞DNA的量,间接反应细胞所处于的分裂期。当研究同型半胱氨酸是否影响脐静脉内皮细胞功能时,最直接且有效的反应就在细胞增殖、凋亡和周期方面。分子水平的功能紊乱是细胞功能紊乱的分子基础。Micro RNAs（miRNAs）是细胞内源性非编码RNA,主要调控靶基因m RNA翻译蛋白水平,进而发挥调控作用。Micro RNAs在细胞增殖中发挥着调控作用。有研究证明Hcy诱导miRNA异常表达,促进疾病发生和发展。但是,其具体潜在的机制仍不清楚。本课题首先探讨高水平同型半胱氨酸是否诱导脐静脉细皮细胞的增殖、凋亡和周期功能异常,并进一步采用RT-q PCR筛选差异表达miRNA。目的:本课题体外研究Hcy是否诱导内皮细胞功能紊乱,包括对细胞增殖、凋亡和周期的作用;以及Hcy是否引起内皮细胞miRNAs的表达异常,其靶基因参与内皮功能紊乱的具体分子机制。方法:体外培养HUVEC,经不同浓度Hcy处理细胞,光镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期、凋亡,CCK8检测细胞增殖;RT-q PCR筛选miRNA及其下游靶基因m RNA的表达变化;结合转染si RNA（miR-21 mimic和miR-21 inhibitor）、慢病毒CDC25A过表达及荧光素酶报告基因检测技术,具体评价Hcy是否通过miR-21靶向调控CDC25A的分子机制,从而影响细胞生长及周期效应。结果:本研究首先通过显微镜白光观察到Hcy干预后导致细胞数量减少和细胞形态畸形变化。通过CCK8测定发现Hcy以剂量依赖方式抑制细胞增殖。我们还观察到Hcy干预后细胞G1/S监测点延迟和G2/M检测点的缺陷。采用RT-q PCR进一步筛选Hcy干预后内皮细胞高峰度表达的15种miRNAs,筛选出miR-21表达显著升高。证明Hcy能诱导miR-21表达,提示miR-21可能在Hcy诱导的内皮功能紊乱中发挥重要作用。miRNA主要通过靶向m RNA抑制基因翻译而发挥调控基因表达的作用。为了进一步明确miR-21在Hcy诱导细胞模型中发挥调控作用的机制,本课题现采用RT-q PCR筛选靶基因CDC25A被HCY抑制,证明miR-21调控靶基因CDC25A的表达。miR-21 mimic能增强Hcy对HUVEC的增殖抑制和周期阻滞效应,但不影响细胞凋亡;用miR-21-5pinhibitor转染细胞后,Hcy对CDC25A的抑制的作用被逆转。此外,我们通过荧光素酶报告基因实验证明CDC25A是miR-21的直接靶基因。最后,我们发现Hcy对细胞增殖和细胞周期的影响能被CDC25A过表达所抑制。结论:HCY诱导miR-21升高表达,并抑制靶基因CDC25A表达引起内皮功能紊乱,即细胞增殖抑制和周期阻滞。具体分为:1)Hcy诱导脐静脉内皮细胞功能紊乱,即抑制增值、促进凋亡和诱导周期阻滞;2)Hcy干预HUVEC后,细胞中miR-21和CDC25A的表达呈负相关;3)miR-21靶向调控CDC25A以影响细胞增殖和细胞周期,Hcy诱导miR-21的作用被CDC25A过表达所逆转。该研究将有益于为改善Hcy诱导的细胞功能紊乱治疗中提供新的分子靶点。