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这几年,PEDV G2群的变异毒株在我国猪群中发病并导致流行,很难将患轮状病毒猪、传染性胃肠炎的猪在临床症状上很难进行区分。准确的检测是防制猪流行性腹泻的重要环节,以免疫层析法技术为基础建立的猪流行性腹泻病毒金标试纸条是一种具有快速、灵敏、特异的PEDV检测方法,对基层现场诊断具有广泛应用价值。目前PEDV的疫苗主要是全病毒灭活苗和弱毒苗两种,这些疫苗或多或少的存在缺点。因此,研发安全、高效的新型PEDV疫苗对防控PED具有十分重要的意义。通过RT-PCR技术扩增HB2015分离毒株N基因,对扩增的N基因进行测序分析,分析结果表明:与2014年德国毒株(GER-L00721-2014)、CH/JXJA/2017、法国毒株KR011756-FR001-2014)、河北毒株(JF700126.1-HB-HS-2010)同源性为99.5%~99.9%。HB2015分离毒株与CV777、CH/S毒株之间的同源性为95.5%~95.6%,存在小幅度的变异。HB2015分离毒株与2014年德国毒株(GER-L00721-2014)、CH/JXJA/2017、法国毒株(KR011756-FR001-2014)、河北毒株(JF700126.1-HB-HS-2010)同属于一个进化分支,HB2015分离毒株属于PEDV G2群的变异毒株。通过pET-32a-N原核表达重组N蛋白,对获得的重组N蛋白进行鉴定后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备单抗,对筛选出的单抗进行Western blotting鉴定、IFA分析和间接ELISA检验。试验结果表明:在大肠杆菌中成功表达的N蛋白具有较好抗原性。筛选出两株能稳定分泌抗PEDV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E7和5D3。间接ELISA均不与猪蓝耳病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫O型抗原、口蹄疫A型抗原发生交叉反应为,腹水效价分别为1:32000和1:64000。两株单抗具有较好的特异性、稳定性和较高的抗体效价。通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金,分别以单抗3E7和5D3制备免疫胶体金和检测线,再以羊抗鼠IgG作为质控线制备金标试纸条,对研制的金标试纸条进行特异性、敏感性和保存期试验。试验结果表明:免疫胶体金最佳单抗3E7标记量的范围在20~30μg/mL。抗原标记的最佳pH值为8.0,NC膜上的检测线单抗5D3含量为0.9mg/mL,NC膜的质控线羊抗鼠IgG含量为1.0mg/mL。金标试纸条不与蓝耳病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫O型抗原、口蹄疫A型抗原发生反应。最低能够检测到225个TCID50的病毒量,4℃可以保存180天。通过分析了国内、外PEDV 31株的S基因核苷酸和S蛋白氨基酸序列的同源性,对S1的390-789aa编码的基因进行优化后,与P28、CD40L、IgG1Fc融合表达。将在杆状病毒系统表达的目的蛋白S1、S1-P28、S1-CD40L、S1-IgG1Fc分别与纳米佐剂和206佐剂乳化后,进行小鼠和猪免疫试验评价。试验结果表明:纳米S1-CD40L组疫苗中和抗体最好切均高于国家制定的标准(1:16),无佐剂组免疫后血清中的检测,S1-CD40L免疫组的IFN-γ和IL-4均高于其它组,说明CD40L可以明显的增加免疫应答。