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背景与目的内毒素是一种危及人类健康乃至生命的病原菌模式分子,内毒素炎症与人类许多疾病密切相关。中药在抗内毒素损伤中表现出一定的优势和特色,中药抗内毒素活性筛选成为研究的热点。本课题组成功构建了斑马鱼内毒素炎症模型,基于此模型评价了不同层次中药(凉膈散复方及其不同提取部位,单味中药甘草及其不同提取部位、单体甘草苷)的抗内毒素活性,探索了斑马鱼浸泡给药方式对于中药抗内毒素筛选的广泛适用性,并且深入研究了凉膈散中活性成分甘草苷抗急性肺损伤(ALI)的作用机制。方法与结果1.采用LPS显微注射卵黄囊构建斑马鱼炎症模型,并浸泡给予凉膈散。生存分析结果发现凉膈散提高斑马鱼生存率;H&E染色结果表明凉膈散降低卵黄囊炎症细胞的浸润;q-PCR结果表明凉膈散抑制促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA表达。荧光拍照、苏丹黑(SB)染色及中性红(NR)染色结果说明凉膈散可抑制中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位的聚集。上述结果说明斑马鱼浸泡给药方式的有效性。2.基于斑马鱼炎症模型评价凉膈散、甘草不同极性提取物、甘草苷的抗炎活性。结果发现凉膈散水提部位、甘草乙酸乙酯部位及单体甘草苷可显著提高斑马鱼生存率,抑制炎性细胞的聚集。3.采用MTT法筛选了甘草苷对于RAW264.7细胞的无毒剂量。采用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型,ELISA结果表明甘草苷剂量依赖性地降低促炎因子TNF-α和IL-6的水平。进一步采用Western blotting检测甘草苷对MAPK通路的影响,结果显示甘草苷抑制JNK在Thr183/Tyr185位点的磷酸化,但对p38在Thr180/Tyr182位点和ERK在Thr202/Tyr204位点的磷酸化无明显影响。此外,甘草苷增加Nur77的表达,降低p-Nur77(Ser351)的水平,抑制c-Jun及p-c-Jun(Ser63)的表达。JNK的特异性抑制剂SP600125和JNK siRNA可协同甘草苷调控Nur77/c-Jun信号通路,而JNK特异性激动剂Anisomycin可拮抗甘草苷的调控作用。过表达JNK后采用双荧光素酶报告基因(Luciferase)检测Nur77的启动子活性,结果发现JNK过表达可抑制Nur77的启动子活性,而甘草苷可拮抗JNK的效果。EMSA及Western blotting结果显示甘草苷通过上调Nur77抑制c-Jun、p-c-Jun(Ser63)及其DNA结合活性。肺组织H&E染色表明甘草苷对LPS诱导ALI具有保护作用,同时甘草苷可降低肺水含量及肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量,降低BALF中TNF-α和IL-6的水平。采用Western blotting检测肺组织蛋白,结果表明甘草苷能够调控JNK/Nur77/c-Jun通路抑制LPS诱导的ALI。JNK激动剂Anisomycin可拮抗甘草苷对ALI的上述保护作用。结论本研究①斑马鱼浸泡给药方式适用于中药抗内毒素筛选;②明确了不同层次中药(复方、单味药、单体成分)的抗内毒素活性;③阐明了甘草苷通过调控JNK/Nur77/c-Jun信号通路抑制LPS诱导的ALI。