论文部分内容阅读
目的:采用基因定点突变技术,将鼻咽癌候选抑瘤基因STGC3中层粘连蛋白G结构域(LG domain)缺失掉,通过观察LG缺失的STGC3基因对人鼻咽癌细胞系CNE2生长增殖的影响,探讨STGC3蛋白质在细胞生长增殖中发挥负性调控作用的结构域。方法:我们前期研究结果提示,LG domain位于STGC3基因所编码蛋白的1~42位氨基酸,应用PCR定点突变方法,缺失掉STGC3基因的LG domain,成功构建pcDNA3.1(+)-STGC3 △142AA真核表达载体,将重组pcDNA3.1(+)-STGC3 △142AA转染入CNE2细胞系,G418筛选,阳性细胞克隆的RT-PCR鉴定,获得稳定转染的CNE2-pcDNA3.1(+)-STGC3 △142AA细胞系。通过CNE2-pcDNA3.1(+)-STGC3△142AA细胞系生长曲线的绘制、细胞克隆形成率检测、细胞周期分析,观察STGC3基因LG domain缺失突变对CNE2细胞生长增殖的影响。结果:重组质粒DNA经酶切和测序鉴定,结果均证实pcDNA3.1(+)-STGC3 △142AA真核表达载体构建成功。经RT-PCR鉴定,成功建立稳定表达STGC3△142AA的CNE2细胞系。细胞生长曲线结果表明:从第3天开始转STGC3 △142AA组和转野生型STGC3基因组细胞生长速度较未转染组及转空载体组减慢(p<0.05),转STGC3 △142AA组细胞生长速度较转STGC3基因组快(p<0.01)。平皿克隆形成实验结果显示:与两对照组相比,转基因组集落生长速度慢、数目少、体积小,克隆形成能力明显降低,转STGC3 △142AA组与转野生型基因组相比,其形成的细胞集落大,数量更多,表明转STGC3 △142AA组细胞生长增殖速度快于转野生型基因组,两组间的差异均有显著性( p<0.01)。经流式细胞仪检测,结果显示:转野生型STGC3基因组和转STGC3 △142AA基因组G0/G1期细胞比例显著高于未转染组和转空载体组(p<0.01),但转STGC3 △142AA组G1期阻滞作用较转野生型基因组下降(p<0.01)。结论:1.成功构建了pcDNA3.1(+)-STGC3 △142AA真核表达载体。2. STGC3基因LG domain的缺失突变,导致该基因的细胞生长增殖负调控作用降低。3. LG domain是STGC3蛋白质的重要功能结构域。