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血管生成是指从已经存在的血管周围生出新的血管的过程。肿瘤组织的血管生成对于肿瘤的生长和转移是必须的,外源性抑制血管生成可以明显的抑制肿瘤的生长,甚至可以使肿瘤消退。因此Folkman提出一个开创性的假说:阻断肿瘤血管生成就可以阻止肿瘤的生长。血管生成是通过调节促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡来实现的。内皮抑素(Endostatin)是一种内源性的抗肿瘤血管生成物质,由O’Reilly等从小鼠血管内皮瘤细胞EOMA的培养液中分离得到的,氨基酸序列显示该物质为胶原ⅩⅧ C末端非胶原区内的184个氨基酸片段。内皮抑素的特异性功能位点尚未研究清楚。有的研究者发现当把C末端部分序列(9个氨基酸:NSFMTSFSK;17个氨基酸:SYIVLCIENSFMTSFSK)去除构成EM1、EM2,并将内皮抑素、EM1和EM2分别作用于肾细胞癌RCC移植瘤动物模型,结果发现EM1保留了内皮抑素的生物学活性,而比EM1多删了8个氨基酸的EM2却无活性,说明了C末端序列上的保守性可能与内皮抑素的生物学活性有关。本研究在克隆基因设计引物时, 选择性的去除内皮抑素C末端13个氨基酸(LCIENSFMTSFSK)相对应的碱基序列,得到内皮抑素的一个突变体,命名为EM13。用基因工程的方法构建了真核表达载体pEGFP-N2-EM13和pEGFP-N2-Endostatin,将两者转入肝癌腹水瘤H22细胞中并进行动物实验,从而达到研究C末端去除是否影响内皮抑素生物学作用的目的。为此作了以下工作:1.从小鼠肝脏组织中提取总RNA,设计合成一对特异性引物,分别带有Xho Ⅰ和Sac Ⅱ的限制性内切酶识别位点。RT-PCR法扩增EM13基因片段,并引入上述两个酶切位点。2.将RT-PCR产物与pMD18-T 载体相连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选出阳性克隆,并以双脱氧末端终止法对重组质粒pMD18-T-EM13进行测序,结果表明与已知小鼠内皮抑素基因序列一致。3.用XhoⅠ和SacⅡ酶切此测序载体,将目的条带回收纯化,将其插入到质<WP=5>粒载体pEGFP-N2相应的酶切位点上,构建表达载体pEGFP-N2-EM13,同时构建表达载体pEGFP-N2-Endostatin。4.脂质体介导的方法将所构建的重组质粒转入肝癌腹水瘤H22细胞中,并将筛选后的H22细胞接种于Balb/c纯系小鼠皮下,观察内皮抑素和EM13对H22细胞体内致瘤能力的影响。结果表明转Endostatin组小鼠的瘤体重量与未转染组的差异虽未有统计学意义,但明显减轻。且肿瘤组织血管密度相对较低,说明转Endostatin基因可使H22细胞的致瘤能力下降。转EM13组小鼠与未转染组小鼠的瘤体重量和血管密度无明显差别,说明转EM13基因对H22细胞的致瘤能力可能没有影响。本研究成功的克隆了小鼠内皮抑素EM13基因,构建了表达载体pEGFP-N2-EM13、pEGFP-N2-Endostatin,并将质粒导入H22细胞中,进行动物实验。结果提示:内皮抑素突变体 EM13可能由于C末端重要的氨基酸被去除而失去了部分抑瘤功能,C末端部分氨基酸可能对其活性的发挥起重要作用,但具体作用和机制需待进一步研究。