[背景]糖尿病慢性难愈性溃疡是指糖尿病患者由于机体长期慢性高血糖导致皮肤软组织血运障碍、神经病变,在皮肤受损情况下容易造成创面3个月以上迁延不愈。皮肤作为人体的第一道物理屏障,也是全身最易受损的器官,其损伤修复过程至关重要。针对糖尿病慢性难愈性溃疡的治疗,目前国内外缺乏针对性强,有效性好的手段。干细胞是糖尿病治疗的新希望,脐带间充质干细胞因其具有改建血管,增强下肢血流、修复糖尿病周围神经病变、调节免疫等作用,干细胞在治疗糖尿病慢性难愈性溃疡的领域受到广泛关注。但干细胞移植固有的全身性风险、效率低下、伦理问题亟待解决,同时,目前研究认为脐带间充质干细胞主要通过旁分泌实现损伤修复,脐带间充质干细胞分泌的外泌体与细胞一样具有修复损伤的作用。目前多项研究表明基于干细胞外泌体的非细胞治疗较细胞治疗更为安全、便捷,具有巨大的临床应用前景,但外泌体治疗存在靶向性不足、作用时间有限等问题。结合我们的前期研究,以水凝胶负载外泌体进行治疗是一种可行的思路。由此,我们将脐带间充质干细胞来源的外泌体与温敏水凝胶进行复合,并对复合体的物理性质以及效果进行了初步验证,为后续的研究奠定基础。[方法]对人脐带间充质干细胞进行培育后,饥饿培养96h后收集上清液,沉淀法提取外泌体,通过BCA蛋白定量、western-blot、扫描电镜、nanosight等方法进行浓度与纯度的鉴定。构建梯度浓度的外泌体凝胶复合体,随后验证其物理性质,测定凝胶时间,进行PKH67侵入试验确定外泌体的侵入效果。最后对脐静脉内皮细胞进行划痕试验,确定凝胶复合体的促迁移、促增殖效果。[结果]收集细胞上清并提取外泌体,可以获得白色沉淀。随后对白色沉淀重悬后进行检测,western-blot显示高表达CD63、CD81,低表达GAPDH;扫描电镜可见典型外泌体结构;BCA定量测量为1617.2 ug/ml;nanosight检测浓度为4.19×1011个/mL,其中30 nm-150 nm范围占44.4%。温敏特性测定显示随着Pluronic F 127浓度的增加,外泌体水凝胶复合体的初始凝胶化温度与37℃凝胶时间逐步降低。PKH67侵入试验显示外泌体凝胶复合体中外泌体侵入细胞的数量远较单纯外泌体更多。划痕试验显示外泌体促进内皮细胞迁移能力最强,细胞提取上清次之,水凝胶与控制组大致相当。[结论]第一部分对提取的外泌体进行纯度与浓度鉴定后,表明所提取的外泌体纯度以及浓度均较高,表明抽提外泌体的方式可行,所抽提的外泌体可用于复合水凝胶的构建。第二部分对复合水凝胶进行温敏性验证后说明复合体温敏特性良好,PKH67侵入试验表明复合水凝胶对外泌体的作用产生了良好的效果,划痕试验表面外泌体是脐带间充质干细胞旁分泌途径中促进内皮细胞迁移的主要成分。这说明新构建的外泌体复合水凝胶具有良好的效果,但仍需要进一步的动物实验以及临床试验进行验证。