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背景与目的随着生活节奏的加快,工作环境压力的增大,生活环境以及饮食结构的改变,人类生育力整体呈现一个下降趋势,不孕不育症已成为我国乃至全球性的公共健康问题。除因女性因素引起的不孕症外,由男性因素导致的不育症也日益增加,国内外多项研究发现男性精子质量近些年整体呈现下降趋势。研究者对男性不育的病因研究愈发深入、愈加成熟,除了目前已知的遗传因素、内分泌因素、环境因素等,精子线粒体与不育之间的研究也逐渐被重视。国外研究者报导发现,精子线粒体基因片段缺失与男性不育之间具有相关性,我们前期研究也发现了精子线粒体ATP6、ND3、ND6和CO1等基因变异与体外受精具有相关性,自2014年以后,精子MT-CO1基因6023位点变异频率骤然升高,但MT-CO1基因变异是自发还是继发,与精子质量之间的关系也知之甚少。在本研究中,我们尝试探讨与精子MT-CO1基因变异有关的基因变异,同时探讨MT-CO1基因变异与精子质量的关系。研究方法1.样本收集1.1收集2019年-2021年就诊于郑州大学第二附属医院生殖中心的27-33岁146例IVF周期男性患者的精液,并与每一份样本的提供者签订了知情同意书,进行前瞻性研究。1.2征集2位精液正常的男性志愿者在2012年及2018年的精子,进行自身前后高通量人全基因组测序对照研究。1.3收集4例少弱精子样本和13例正常精子样本,进行低通量人全基因组测序。2.实验方法1.1提取精子DNA,进行巢式PCR,对PCR产物扩增与提纯。1.2将纯化后的PCR扩增产物送至北京鼎国公司进行MT-CO1测序;将2例正常生育男性志愿者2012年和2018年精子样本、4例少弱精子样本和13例正常精子样本送至华大基因公司进行人全基因组测序。1.3利用PubMed公开数据库,检索弱精子症,弱畸精子症,正常精子转录组数据集。1.4利用DNA star（v7.1）对比分析MT-CO1测序结果6023位点是否变异,进行记录分析。利用Visual Studio Code（v1.62）和Microsoft Excel对人全基因组低通量测序结果进行比对筛选,筛选出少弱精子症组和正常精子组特有的单核苷酸多态性位点。利用R软件包（v4.1.2）对符合检索条件的数据集进行转录组差异分析,安装dplyr包和sva包,利用merge函数对数据集进行合并,生成表达矩阵和样本矩阵,利用Combat函数对合并后的数据集进行批次效应去除,进行数据标准化。1.5将146例样本按MT-CO1基因6023位点G是否变异成A,将样本分为A/A基因型与G等位基因携带型（G/G+G/A）,观察MT-CO1基因变异情况;评价MT-CO1基因变异与精液质量的关系。根据少弱精子症组和正常精子组的基因组测序结果,筛选出与少弱精子症有关的SNP位点。根据对公开的转录组数据集的二次分析,挑筛出与弱精子症、弱畸精子症有关的差异基因。统计学方法采用IBM-SPSS（V21.0）统计软件处理数据,计量资料正态分布应用平均数±标准差表示,计量资料偏态分布应用中位数（四分位数间距）表示,分类计数资料应用数和百分比表示。正态分布计量资料用t检验分析,非正态分布计量资料采用非参数检验,计数资料采用卡方检验和Fisher精确检验（①所有单元格的理论数T≥5且总样本量n≥40,用Pearson卡方进行检验;②若单元格理论数T＜5但T≥1,且总样本量n≥40,用连续性校正的卡方进行检验;③若单元格理论数T＜1或总样本量n＜40,用Fisher精确检验）。所有分析均采用双侧检验,P＜0.05认为差异具有统计学意义。结果1.2例志愿者进行精子MT-CO1基因变异前后的全基因组测序自身对照研究,筛选出SLC9B1基因rs753242024的缺失和SLITRK4基因PolyT的缺失为可能引起精子MT-CO1基因6023位点变异的高风险因素。后续对其进行验证,结果显示SLC9B1基因rs753242024和SLITRK4基因PolyT在各个样本中均未发生缺失。2.146例有效精子样本根据测序结果分组为A/A基因型和G等位基因携带型（G/G+G/A）,统计分析发现精子密度与精子活力在两组之间均具有统计学意义（精子密度P=0.041;精子活力P=0.037）,少/弱精子症发生率在两组间的差异具有统计学意义（P=0.030）,A/A基因型的精子活力和精子密度高于G等位基因携带型（G/G+G/A）,G等位基因携带型（G/G+G/A）的少/弱精子症发生率高于A/A基因型。3.G/A基因型的X染色体的DNAAF6基因（又称为PIHID3）在正常精子组含有23个特有的SNP位点,在少弱精子症组含有14个特有的SNP位点。少弱精子症组的14个SNP,其中有5个为新发现的SNP位点,其中107243978位点为DNAAF6基因转录本的1683位点,且这个位点为3’UTR区域。通过miRDB在线预测,DNAAF6基因转录本1683位点的上游可能有hsa-miR-4311与DNAAF6基因转录本的3’UTR结合。4.对公开精子转录组数据集的二次分析发现,弱精子症、弱畸精子症与正常精子间无差异基因。结论1.SLC9B1基因rs753242024的缺失和SLITRK4基因PolyT的缺失不是导致精子MT-CO1基因6023位点变异的因素。2.精子MT-CO1基因6023位点A/A基因型是精子质量的保护性因素。3.DNAAF6基因转录本1683位点变异可能通过影响转录本的稳定性而影响基因的表达量。