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沙门氏菌引起的猪消化道疾病,多发于各大养殖场,且死亡率较高,是引起仔猪死亡的主要原因之一,给养猪业的发展造成了严重的经济损失。近年来从动物和动物源食品中分离到的沙门氏菌逐渐对多种抗生素表现出敏感性下降。安普霉素作为动物专用药,被广泛的应用于畜禽的消化道疾病的预防与治疗,且由于安普霉素具有促生长的作用,也常被作为抗生素添加剂使用,当前养殖业用药的不规范使得临床耐药现象日趋严重,耐药检测具有必要性和紧迫性。我国目前还没有制定耐药监测的相关标准,为了监测耐药性的产生,指导临床合理用药,本课题参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）和欧洲药敏实验委员会（EUCAST）中推荐的折点制定方法,建立了安普霉素对沙门氏菌的耐药判定标准。1安普霉素对猪源沙门氏菌的野生型临界值的制定参考CLSI推荐的琼脂稀释法测定了实验室前期从湖南、湖北和河南三地养殖场采集分离到的185株沙门氏菌对安普霉素的最小抑菌浓度（MIC）,得到安普霉素对沙门氏菌的MIC50为8μg/m L,MIC90为16μg/m L,将获得的MIC数据带入Ecoffinder软件进行非线性回归模拟分析,得到沙门氏菌对安普霉素的野生型临界值为32μg/m L。2安普霉素对猪源沙门氏菌药效学临界值的制定及给药方案的确定对185株沙门氏菌进行毒力基因检测,筛选出含有毒力基因较多,毒力较强的菌株13株,然后进行小鼠毒力试验,选用7-12周龄的健康昆明小鼠,分别在小鼠腹腔接种10~7CFU/m L和10~9CFU/m L的对数生长期菌液,每个剂量组接种3只,观察小鼠死亡情况,最终筛选出在MIC50、MIC90、野生型临界值及其附近的5株致病性较强的菌株,选择MIC50菌株10#进行后续的PK-PD试验。采用微量肉汤稀释法测定安普霉素在MH肉汤和无菌回肠内容物中对沙门氏菌10#的MIC和最小杀菌浓度（MBC）,测得在MH肉汤和无菌回肠内容物中MIC均为8μg/m L,MBC均为16μg/m L。通过平板涂布法测定安普霉素对沙门氏菌10#的最小防突变浓度（MPC）为64μg/m L。将沙门氏菌暴露在不同浓度的安普霉素1 h和2 h后,测定安普霉素对沙门氏菌的抗菌后效应（PAE）分别为0.51 h～1.42 h和0.45h～6 h。根据所测的MIC,设置不同浓度的安普霉素与沙门氏菌10#孵育,在不同时间点进行平板计数,绘制出安普霉素对沙门氏菌10#的体外杀菌曲线;将各个时间点采集到的回肠内容物进行无菌处理后,与细菌孵育,绘制出安普霉素对沙门氏菌的半体内杀菌曲线。通过杀菌曲线确定安普霉素对沙门氏菌的抗菌作用类型为浓度依赖型,PK-PD参数选择AUC/MIC。试验选用6头15 kg左右的断奶仔猪,手术安装回肠瘘管,设立健康组和患病组,建立安普霉素的血浆药动模型和消化道药动学模型。以30 mg/kg b.w灌胃给药后,在0.5、1、2、4、5、6、8、10、12、24和48h分别从健康组和疾病组采集血浆和回肠内容物。根据建立的高效液相色谱串联质谱方法,检测不同时间点血浆和内容物中的药物浓度。使用Winnonlin软件中的非房室模型药动学数据进行模拟,得到安普霉素在健康猪和患病猪的Cmax为863.4μg/m L和750.5μg/m L,AUC为3287.25 h·μg/m L和2855.83 h·μg/m L,Tmax均为3h。根据半体内杀菌曲线的结果,计算安普霉素在不同浓度下的半体内AUC24/MIC。使用Sigmoid Emax方程进行模拟,得到E=0,-3,-4时(AUC24/MIC)ex分别为46,58.38,56.53。带入蒙特卡洛模拟分析10000头猪的数据,得到不同MIC值下AUC24/MIC的达标率,取达标率大于等于90%时的MIC为药效学临界值,即在消化道中安普霉素对沙门氏菌的药效学临界值为32μg/m L。通过剂量方程,计算得到预防、治疗和根除的安普霉素给药剂量分别为4.15 mg/kg b.w、5.27mg/kg b.w、5.91 mg/kg b.w。根据群体混饲给药方程计算出安普霉素混饲的预防、治疗和根除剂量分别为为83 mg/kg、105.4 mg/kg和118.2 mg/kg。3安普霉素对猪源沙门氏菌临床临界值的制定将试验仔猪（15kg左右）39头分为7组,空白组3头,剩下每组6头,一组为阴性对照组,剩下五组为通过毒力试验筛选出的5株不同MIC组,确定攻毒感染成功后,根据PK-PD推荐的给药方案混饲105.4 mg/kg,一天一次,连续三天进行给药,通过临床症状评分和实时活菌菌落计数,统计临床治愈率。目前并没有明确的方法来制定临床临界值,本试验采用使用“Windo W”和CART分析法对MIC和POC数据进行分析,使用“Windo W”法分析计算Max Diff和CAR,得到临床临界值的选择窗为8μg/m L～32μg/m L;使用CART回归树分析得到的临床临界值的范围是8μg/m L～12μg/m L,根据MIC分布最终确定临床临界值为8μg/m L。综合考虑得到的野生型临界值、药效学临界值和临床临界值,参考CLSI的折点制定流程图,当COPD＞COWT＞COCL时耐药折点值等于野生型临界值,确定最终的安普霉素的对沙门氏菌的耐药判定标准为32μg/m L。