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目的:本实验研究V-ATPase非特异性抑制剂—奥美拉唑逆转人肺腺癌耐药株A549/DDP细胞耐药性作用及可能机制。方法:选用人肺腺癌耐药株A549/DDP为研究对象,采用MTT法测定顺铂(DDP)对A549及A549/DDP细胞的半数抑制浓度(IC50),以此判断A549/DDP细胞的耐药性情况。采用MTT法确定奥美拉唑(Omerprazole,简称OME)非细胞毒性剂量:取低于10%抑制浓度(inhibiting concentration,IC10)作为药物作用浓度:OME4μg/ml。在此浓度逆转剂作用下测定顺铂对A549/DDP细胞的半数抑制浓度(IC50),以此判断OME对耐药细胞药物敏感性的影响。光学显微镜观察细胞形态学改变。运用流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)测定加入逆转剂后对A549/DDP细胞株的细胞周期影响。运用流式细胞仪检测有无逆转剂作用下A549/DDP细胞中Bcl-2和PTEN蛋白表达的情况。应用激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy,LSCM)检测OME处理前后细胞内BCECF-AM(pH探针)荧光强度的变化,间接反映细胞内pH之变化。采用半定量逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测V-ATPase mRNA在人肺腺癌细胞株A549细胞和耐顺铂细胞株A549/DDP中表达情况。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测有无逆转剂作用下A549/DDP细胞中Bcl-2 mRNA和PTEN mRNA表达的情况。结果:MTT法测定DDP对A549细胞的IC50为1.9μg/ml,DDP对A549/DDP细胞的IC50为43.4μg/ml。OME对A549/DDP细胞的IC10为8.7μg/ml。选取非细胞毒作用浓度为4μg/ml的OME为逆转剂,在经逆转剂预处理24h情况下,DDP对A549/DDP细胞的IC50由43.4μg/ml降至30.1μg/ml,逆转倍数约为1.44,与无逆转剂组相比具有显著性差异(P<0.01)。光镜下显示,空白对照组及阴性对照组细胞形态为梭形或多形性,形态饱满,胞体折光性好,其增殖快速,实验组细胞增大,边缘模糊,胞体折光性减弱。细胞可变圆脱壁,部分细胞胀大破裂。高倍镜下可见细胞明显破碎,培养液中可见到大量细胞碎片。流式细胞仪检测结果表明经OME预处理后细胞周期受到影响,G1期细胞明显增多,S期细胞则相对减少,与无逆转剂组相比具有显著性差异(P<0.01)。其中实验组细胞中OME对细胞周期的影响可能主要以阻滞A549/DDP细胞于G1期为主。流式细胞仪检测加入OME逆转剂组与未加逆转剂组细胞中Bcl-2蛋白表达由1降至0.8,PTEN蛋白表达由1升至1.02。二者各自相比均具有显著性差异(P<0.01)。激光扫描共聚焦显微镜检测OME处理后细胞内BCECF-AM(pH探针)绿色荧光强度明显增强,间接反映OME处理后细胞内pH明显减低。RT-PCR结果显示V-ATPase在A549及A549/DDP中相对表达量分别为0.88和0.99,二者相比具有显著性差异(P<0.01)。RT-PCR结果显示V-ATPase在有无OME逆转剂处理情况下的相对表达量分别为1.05和1.09,二者相比无统计学差异(P>0.05)。RT-PCR结果显示在加入OME逆转剂预处理24h与未OME逆转剂处理情况下两组A549/DDP中Bcl-2的相对表达量由0.9降至0.8,二者相比具有显著性差异(P<0.01);PTEN的相对表达量由0.25升至0.29,二者相比具有显著性差异(P<0.01)。结论:1、本研究通过体外实验证明了V-ATPase在人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP较人肺腺癌细胞株A549细胞中表达增多,为以V-ATPase为作用靶点的而进行逆转肿瘤耐药开辟了一条极具潜力的有效途径。2、本实验表明,通过非细胞毒浓度的OME预处理24小时后,可以使A549/DDP细胞停滞于G1期,并可抑制人肺腺癌耐药株A549/DDP增殖。3、非细胞毒浓度的OME部分逆转人肺腺癌耐药株A549/DDP细胞耐药性的作用机制可能与上调PTEN蛋白和下调Bcl-2蛋白表达有关。4、本实验证实了OME可以作为一种理想的MDR逆转剂进行后续研究。